dc.contributor.author
Jia, Junyong
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:49:31Z
dc.date.available
2007-06-12T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1655
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5857
dc.description
Title and directory
Abstract
Introduction
Aims of the studies
Materials and methods
Results
Discussion
Conclusions
Bibliography
Appendix
List of publications
dc.description.abstract
Specific membrane lipids have been proposed to regulate protein sorting during
the exo- and endocytic pathways at multiple stages. This includes the
formation of membrane microdomains, and membrane shape changes induced by
recruitment of peripheral proteins. Here we have addressed both mechanisms in
two distinct experimental systems: (1) the recycling of synaptic vesicles
(SVs) at nerve terminals and (2) membrane deformation at the Golgi/endosomal
boundary. SVs in the central nervous system upon stimulation undergo rapid
calcium-triggered exo-endocytic cycling within the nerve terminal which at
least in part depends on components of the clathrin- and dynamin-dependent
endocytosis machinery. How exocytic SV fusion and endocytic retrieval are
temporally and spatially coordinated is still an open question. One
possibility is that specialized membrane microdomains characterized by their
high content in membrane cholesterol may assist in the spatial coordination of
synaptic membrane protein recycling. Quantitative proteomic analysis of
detergent-resistant lipid microdomains (DRMs) isolated from rat brain synapses
or cholesterol-depleted control samples by liquid chromatography tandem mass
spectrometry identified a total of 159 proteins. Among these 122 proteins were
classified as cholesterol-dependent DRM or DRM-associated proteins, many of
which with proven or hypothesized functions in exo-endocytic vesicle cycling
including clathrin, the clathrin adaptor complex AP-2, and a variety of SV
proteins. In agreement with this SV membrane and endocytic proteins display a
partial resistance to extraction with cold Triton X-100 in cultured rat
hippocampal neurons where they co-localize with labeled cholera toxin B, a
marker for cholesterol-enriched DRMs. Moreover, SV proteins form cholesterol-
dependent complexes in CHAPS-extracted synaptic membrane lysates. Membrane
traffic at the Golgi/endosomal boundary requires the action of Arfs (ADP
ribosylation factors), NH2-terminal myristoylated proteins that belong to the
Ras superfamily of small GTP binding proteins. We demonstrate that bothwild
type myristoylated and non-myristoylated recombinant Arf1 and Arf6 can bind to
liposomes and bend them into tubular structures as observed by electron and
video microscopy. Mutations of hydrophobic residues within the amphipathic
helices abolish their liposome binding or tubulation capacity. Co-
overexpression of Arf1-EGFP and FAPP-PH domain, a PI4P-binding protein module,
in COS7 cells produces enormous tubules from a perinuclear compartment. In
comparison, Arf1 NH2-terminal hydrophobic residue mutants show a cytosolic
localization similar to GDP-locked Arf1 T31N. The NH2-terminal amphipathic
helix itself is sufficient to drive membrane curvature generation when
overexpressed in COS7 cells. These data identify a novel GTP-controlled switch
that regulates membrane deformation during budding of coated vesicles and
tubules at the Golgi/endosomal boundary.
de
dc.description.abstract
Möglicherweise können bestimmte Membranlipide die Proteinsortierung während
der Exo- und Endocytose auf verschiedenen Ebenen regulieren. Dies könnte z.B.
durch die Formierung sog. Membranmikrodomänen aber auch durch Veränderung in
der Membrangestalt, induziert durch die Bindung peripherer Proteine,
geschehen. In dieser Arbeit wurden beide Mechanismen durch zwei verschiedene
experimentelle Systeme untersucht: 1) Recycling synaptischer Vesikel an
Nervenendigung und 2) Membranveränderungen an der Golgi/Endosomen-Grenze.
Synaptische Vesikel im zentralen Nervensystem werden nach Stimulierung einem
schnellen, Calcium-induzierten, exo- und endocytischen Zyklus unterworfen.
Dieser hängt zumindest teilweise von Komponenten der Clathrin und Dynamin-
abhängigen Endocytose-Maschinerie ab. Wie die Vesikelfusion und die Aufnahme
zeitlich und räumlich koordiniert werden ist ungewiss. Eine Möglichkeit ist,
dass spezialisierte Membrandomänen, die durch einen hohen Gehalt an
Cholesterin charakterisiert sind, die räumliche Voraussetzung schaffen, um
synaptische Membranproteine aufzunehmen. Quantitative Proteinanalysen von
Detergenz-resistenten Lipidmikrodomänen (DRMs) aus Rattengehirnsynapsen oder
aus Cholesterin depletierten Kontrollen, ergaben nach massenspektroskopischen
Untersuchungen 159 Proteine. Darunter waren 122 Proteine als Cholesterin-
abhängige DRM oder DRM-assoziierte Proteine aufgeführt, viele davon mit
bewiesener Funktion im exo-und endocytischen Vesikelkreislauf. Darunter waren
Clathrin, der Clathrin Adaptor Komplex AP-2 und verschiedene synaptische
Vesikelproteine. In Übereinstimmung damit sind Vesikelmembranproteine und
endocytierte Proteine gegenüber einer Extraktion mit kaltem Triton in
kultivierten Rattenhippocampus-Neuronen resistent. Hier kolokalisieren sie mit
markiertem Choleratoxin B, einem Protein das spezifisch für cholesterinhaltige
DRMs ist. Darüberhinaus formen Vesikelproteine Cholesterin abhängige Komplexe
in CHAPS extrahierten Membranlysaten. Membranverkehr an der Golgi/endosomalen
Grenze benötigt ARFs (ADP ribosylation factors), NH2- terminal myristoylierte
Proteine, die zur Ras Superfamilie kleiner GTP-bindender Proteine gehören. Wir
zeigen Normales und nicht myristoyliertes rekombinantes Arf1 und Arf6 können
an Liposomen binden und sie zu tubulären Strukuren krümmen, wie man im
Elektronen und Videomikroskop sehen konnte. Mutationen hydrophober
Bestandteile der amphipathischen Helix zerstörten die Fähigkeit Liposomen zu
krümmen. Überexpression von Arf1-EGFP und FAPP-PH, einem PI(4)P bindenden
Proteinbaustein, in COS7 Zellen ergab enorme tubuläre Strukturen aus einem
perinukleärem Kompartiment. Dagegen zeigten Arf1 Mutanten deren NH2 terminale
hydrophobische Bestandteile verändert wurden, eine zytosolische Lokalisation,
die ähnlich der GDP-gesperrten Arf1 Mutante T31N war. Die NH2 terminale
amphipathische Helix selbst genügt, um bei Überexpression in Cos7 Zellen
Membrankrümmung zu erreichen. Diese Daten identifizieren einen neuen GTP-
kontrollierten Schalter, der die Membrandeformation während der
Vesikelausknospung an der Golgi/endosomalen Grenze regulieren kann.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
lipid protein trafficking
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Lipid and protein regulation of membrane trafficking
dc.contributor.firstReferee
Professor Dr. Volker Haucke
dc.contributor.furtherReferee
Professor Dr. Petra Knaus
dc.date.accepted
2007-06-06
dc.date.embargoEnd
2007-06-14
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002950-6
dc.title.translated
Regulation von Membrantransportvorgängen durch Lipide und Proteine
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000002950
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2007/425/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000002950
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access