Cardiac analysis of endothelin-1 transgenic and endothelial nitric oxide synthase knock-out mice

Abstract

The hormone Endothelin‐1 (ET‐1) exerts vasoconstrictive, inotropic, fibrotic and mitogenic effects on the cardiovascular system through the activation of ET receptor A. On the other hand, activation of ET receptor B stimulates the endothelial nitric oxide synthase (eNOS); NO presents strong vasodilative and cardioprotective properties and represses ET‐1 expression. The clinical relevance of this delicate interplay has been acknowledged because of its implication in many cardiovascular diseases, such as pulmonary arterial hypertension, systemic hypertension, and coronary artery disease. However, the underlying molecular mechanisms remain to be fully clarified. ET‐1 transgenic (ET+/+) mice develop pulmonary, cardiac and renal fibrosis, glomerulosclerosis and decreased glomerular filtration rate. However, in spite of the strong vasoconstrictive feature of ET‐1, ET+/+ mice remain normotensive. The natural functional antagonist of ET‐1, NO, was assumed to counteract the ET‐1 effect on blood pressure in ET+/+ mice. To test this hypothesis in vivo, ET+/+ mice were crossbred with eNOS knock‐out (eNOS‐/‐) mice. Similar to the eNOS‐/‐ model, the ET+/+eNOS‐/‐ mice develop high blood pressure compared to wild type (WT) and ET+/+ animals. However, at the age of nine months, the eNOS‐/‐, but not ET+/+eNOS‐/‐ mice, are characterized by diastolic dysfunction. These findings suggested that transgenic overexpression of ET‐1 on an eNOS‐/‐ background could be beneficial for diastolic functions. In this thesis, it is shown that cardiac ET‐1 gene expression was elevated in both eNOS‐/‐ and ET+/+eNOS‐/‐ mice compared to WT at the age of nine months with no significant difference between these groups. This suggests that the functional differences observed between eNOS‐/‐ and eNOS‐/‐ET+/+ animals are due to the chronic overexpression of ET‐1 mediated by the transgene, which may have conditioned ET+/+eNOS‐/‐ animals over time to prevent the development of diastolic dysfunction. In line with this, eNOS‐/‐ animals displayed normal cardiomyocyte diameters at the age of three months, but developed cardiac hypertrophy at the age of nine months, whereas ET+/+eNOS‐/‐ mice showed enlarged cardiomyocytes at the age of three months that were not detectable in animals nine months of age. Histological analysis showed that cardiac arterioles were dilated in both ET+/+ and ET+/+eNOS‐/‐ mice compared to WT and eNOS‐/‐ mice. By enhancing blood flow, this could be beneficial for cardiac functions. In order to dissect the molecular changes underlying this phenomenon, the cardiac proteome of the different genotypes were compared to WT using two‐dimensional electrophoresis coupled to mass spectrometry. Because these changes may take place early in the life of the animals, three months old animals were analyzed. The proteomics study revealed that transgenic overexpression of ET‐1, with or without eNOS, led to a higher abundance of proteins regulating oxidative stress indicating that, in contrast to eNOS‐/‐ animals, ET+/+ and ET+/+eNOS‐/‐ mice developed molecular mechanisms limiting oxidative damages. Moreover, diastolic dysfunction observed in eNOS‐/‐ mice may be explained by the differential abundance of proteins involved in the contractile machinery. Overexpression of ET‐1 in eNOS‐/‐ mice restored these changes and may have thereby benefited the cardiac functions. Finally, this study indicated that a shift from fatty acid to glucose metabolism, considered as cardioprotective, may have occurred to a greater extent in crossbred animals than in eNOS‐/‐ mice. Taken together, this study showed that transgenic overexpression of ET‐1 in mice can have beneficial effects on cardiac function, even in the absence of eNOS, by modulating various systems (oxidative stress, contractile machinery, and energy metabolism). The clinical relevance of these findings should be confirmed by analyzing the impact of a pharmacological interference with these systems on cardiac function. Finally, the fact that additional overexpression of ET‐1 restored the deleterious effect of eNOS deficiency underlines the importance of the interplay between the two systems in the heart of mice.

Endothelin‐1 (ET‐1) ist ein Peptidhormon, das durch Aktivierung des ET‐1 Rezeptors A vasokonstriktorische, inotrope, fibrotische und mitogene Effekte im kardiovaskulären System vermittelt. Gleichzeitig stimuliert Aktivierung des ET‐1 Rezeptors B die endotheliale Stickstoffmonoxid‐Synthase (eNOS), wobei NO starke vasodilatative and kardioprotektive Eigenschaften aufweist und die ET‐1 Expression hemmt. Aufgrund seines wesentlichen Einflusses auf zahlreiche Erkrankungen des kardiovaskulären Systems wie zum Beispiel die pulmonal‐arterielle und systemische Hypertonie oder die koronare Herzerkrankung ist dieses fein abgestimmte Gleichgewicht von erheblicher klinischer Relevanz; die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen konnten bislang jedoch nur unvollständig identifiziert werden. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass transgene Mäuse mit einer ET‐1 Überexpression eine pulmonale, kardiale und renale Fibrose sowie eine Glomerulosklerose mit verminderter glomerulärer Filtrationsrate entwickeln. Interessanterweise zeigen diese Tiere jedoch trotz der bekannten vasokonstriktorischen Effekte von ET‐1 keine Hypertonie. Um die Hypothese, dass dies auf eine Antagonisierung der ET‐1 Wirkung durch NO zurückzuführen ist, in einem in vivo System zu überprüfen, wurden ET+/+ Mäuse mit eNOS knock‐out Tieren (eNOS‐/‐) gekreuzt. Analog zum Phänotyp der eNOS‐/‐ Tiere zeigte sich in diesem kombinierten ET+/+eNOS‐/‐ Modell eine arterielle Hypertonie. Während eNOS‐/‐ Mäuse jedoch im Alter von neun Monaten eine diastolische Dysfunktion entwickelten, waren diese Veränderungen im kombinierten ET+/+eNOS‐/‐ Modell nicht nachzuweisen, so dass sich damit Hinweise für einen möglichen protektiven Effekt der ET‐1 Überexpression auf die diastolische Funktion ergaben. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass sowohl eNOS‐/‐ als auch ET+/+eNOS‐/‐ Tiere im Alter von neun Monaten eine im Vergleich zu Wildtypkontrollen erhöhte ET‐1 Expression zeigen, die sich zwischen diesen Gruppen nicht signifikant unterscheidet. Dies deutet darauf hin, dass die funktionellen Unterschiede zwischen beiden Modellen darauf zurückzuführen sein könnten, dass die Expression des ET‐1 Transgens in ET+/+eNOS‐/‐ Tieren zu einer bereits früh beginnenden ET‐1 Überexpression führt, während sich dies in eNOS‐/‐ Mäusen erst im Verlauf entwickelt. Eine chronische ET‐1 Überexpression könnte so im kombinierten ET+/+eNOS‐/‐ Modell zu einer Konditionierung der Tiere führen, die im weiteren Verlauf die Entwicklung einer diastolischen Dysfunktion verhindert. Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass eNOS-/‐ Tiere im Alter von drei Monaten normale Kardiomyozytendurchmesser aufweisen, im Alter von neun Monaten jedoch eine kardiale Hypertrophie entwickeln, während eine im Alter von drei Monaten in ET+/+eNOS‐/‐ Mäusen nachweisbare Vergrößerung der Kardiomyozytendurchmesser in neun Monate alten Tieren nicht mehr nachweisbar ist. Histologisch zeigte sich darüber hinaus im Vergleich zu Wildtyp‐Kontrollen und eNOS‐/‐ Tieren sowohl in ET+/+ als auch in ET+/+eNOS‐/‐ Mäusen eine Dilatation kardialer Arteriolen, so dass eine vermehrte myokardiale Durchblutung zu den beobachteten funktionellen Unterschiede beitragen könnte. Um die molekularen Mechanismen, die diesen Beobachtungen zugrunde liegen, zu analysieren, erfolgte ein Vergleich des kardialen Proteoms jeder Genotypen mit Wildtyp Kontrollen durch zweidimensionale Elektrophorese in Kombination mit Massenspektrometrie. Hier zeigte sich, dass die Überexpression von ET‐1 sowohl im Wildtyp als auch im eNOS ‐/‐ Hintergrund zu einer höheren Expression von Proteinen der oxidativen Stressantwort führt. Dies deutet darauf hin, dass ET+/+ and ET+/+eNOS‐/‐ Tiere im Gegensatz zu eNOS‐/‐ Mäusen molekulare Mechanismen entwickelt haben, um Schäden durch oxidativen Stress zu limitieren. Darüberhinaus war die beobachtete diastolische Dysfunktion in eNOS‐/‐ Mäusen mit Änderungen in der Expression von Proteinen, die bei der Regulation kontraktiler Prozesse eine Rolle spielen, assoziiert. ET‐1 Überexpression führte in eNOS‐/‐ Tieren zu einer Antagonisierung dieser Veränderungen. Schließlich zeigte sich in diesen Untersuchungen, dass im ET+/+eNOS‐/‐ Modell im Gegensatz zu eNOS‐/‐ Tieren in höherem Maße eine Verschiebung vom Fettsäure‐Metabolismus zur vermehrten Glukose‐Utilisation erfolgt, die als kardioprotektiv betrachtet wird. Zusammenfassend wird in der vorliegenden Arbeit damit gezeigt, dass eine chronische Überexpression von ET‐1 in Mäusen durch die Modulation verschiedener Systeme (oxidativer Stress, Kontraktionsprozesse, Energiemetabolismus) auch in Abwesenheit der eNOS protektive Effekte auf die kardiale Funktion haben kann. Untersuchungen zum Einfluss einer pharmakologischen Modulation dieser Systeme auf kardiale Funktionsparameter könnten dazu beitragen, die klinische Relevanz dieser Beobachtungen zu überprüfen.