Eine revers-genetische Analyse des reassortierten humanen Influenza A-Virus H1N2

Abstract

Reassortierungen zwischen Influenza A-Viren verschiedener Subtypen sind ein seltenes Ereignis. Selbst in Regionen, in denen Viren der Subtypen H1N1 und H3N2 kozirkulieren bilden sich selten Misch-Viren eines neuen Subtyps, die dauerhaft zirkulieren. Dies lässt vermuten, dass die H1N2-Viren, die in den Jahren 2001-2003 auftraten gegenüber den parentalen „Elternstämmen“ neue Eigenschaften besaßen, die erstmalig ihre weite Verbreitung ermöglichten. In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften von WT und rekombinanten H1N2-Viren in vergleichenden Experimenten mit den parentalen Stämmen A/Moscow/10/99 (H3N2) und A/NewCaledonia/20/99 (H1N1) charakterisiert. Auffällig war eine besonders hohe Replikationsfähigkeit des WT-Isolates A/Sachsen/1816/02 (H1N2). Die Rezeptor-bindenden Eigenschaften dieses Virus, vermittelt durch das Oberflächenglykoprotein HA, entsprachen denen des parentalen H1N1-Stammes A/NewCaledonia/20/99. Die Replikationseigenschaften waren jedoch denen der untersuchten H3N2-Subtypen ähnlicher. Die Neutralisierbarkeit der H1N2-Viren durch H1-Antiseren war in hohem Maße gegeben. Dennoch waren Unterschiede in der Neutralisierbarkeit durch ein H1-Patientenserum erkennbar, die vermutlich durch punktuelle Aminosäureaustausche, vor allem im HA1 bedingt waren. Hinweise aus Experimenten mit NK-Zellen und deren Rezeptoren NKp44 und NKp46 zeigten, dass diese Mutationen auch zu immunologischen Vorteilen durch geringere Erkennung H1N2-Virus-infizierter Zellen durch NK-Zellen, bzw. deren aktivierenden Rezeptor NKp44 geführt haben könnten. Das M-Segment der WT H1N2-Isolate zeigte eine größere genetische Nähe zum Stamm A/Panama/2007/99 (H3N2), während die anderen sechs Segmente von A/Moscow/10/99 (H3N2)-ähnlichen Viren abstammten. Der Vergleich der Replikationseigenschaften rekombinanter H1N2-Viren, deren Genom sich nur durch das M-Segment unterschied zeigte, dass Viren mit dem A/Moscow-M-Segment schneller und zu höheren Titern replizierten, als Viren mit homologem A/Panama-M-Segment. Die genetische Komposition der WT H1N2-Viren, die interne Gensegmente von zwei H3N2-Stämmen vereinte, war für diese Viren demnach nicht mit replikativen Vorteilen verbunden. Weitere Reassortierungsereignisse der H1N2-Viren hätten, begünstigt durch eine längere Zirkulationsdauer möglicherweise zu beständiger Zirkulation der Viren geführt. Hinweise darauf gab eine H1N2-Reassortante mit homologem NA-Segment des Stammes A/Panama statt A/Moscow (rNC4-P6/7-M), bei der deutlich höhere Replikationstiter nachgewiesen werden konnten als beim rekombinanten H1N2-„Referenzvirus“ rNC4-P7-M. Mit diesen Ergebnissen konnte erstmals eine Studie zur Vermehrungsfähigkeit eines WT H1N2-Isolates und einer definierten Palette rekombinanter H1N2-Viren sowie deren Reaktivität gegenüber neutralisierenden Antikörpern von Immunseren und gegenüber NK-Zellen gezeigt werden. Sie zeigen, dass die H1N2-Viren der Jahre 2001-2003 gute Vorraussetzungen besaßen, als H1-Viren aufgrund der funktionellen Balance eines H1-Hämagglutinins mit einer N2-Neuraminidase kontinuierlich zu zirkulieren. Vor allem die gute Replikationsfähigkeit und Vorteile durch Antigen-Drift der beiden Glykoproteine gegenüber Komponenten des Immunsystems können als Ursache für Ihre schnelle weltweite Verbreitung angesehen werden. Die Tatsache, dass diese Viren nicht mehr zirkulieren, belegt jedoch, dass sich diese Viren vermutlich nicht schnell genug veränderten, um sich gegenüber der „herd immunity“ ihrer Wirte langfristig zu behaupten und neben H1N1-Viren zu zirkulieren.

Reassortment between influenza A viruses of different subtypes rarely appears. Even in a community where H1N1 and H3N2 viruses co-circulate, reassortment to produce persistent viruses of mixed gene segments does not readily occur. H1N2 viruses, that circulated between 2001-2003 were considered to have arisen through the reassortment of the two human influenza subtypes H1N1 and H3N2. Due to the fact they make such a rare appearance, H1N2 viruses used to have new characteristics compared to their parental strains that enabled their widespread geographical distribution. We compared the replication properties of wt and recombinant H1N2 viruses with parental strains A/Moscow/10/99 (H3N2) and A/NewCaledonia/20/99 (H1N1). Notably, wt strain A/Sachsen/1816/02 (H1N2) replicated to very high virus titres. Whereas the receptor-binding properties corresponded to those of parental strain A/NewCaledonia/20/99 (H1N1), replication properties of the wt H1N2 strain were more common with those of A/Moscow/10/99 (H3N2)-like viruses. To determine antigenetic characteristics, neutralisation assays using a ferret antiserum generated against A/NewCaledonia/20/99 (H1N1) and a human serum were performed. H1N2 viruses were well inhibited by both antisera, although in presence of the human antiserum, they replicated to higher titres compared to reference strain A/NewCaledonia/20/99 (H1N1). Phylogenetic analysis showed that wt H1N2 viruses had signature amino acid changes in HA and NA compared to their parental strains. It was shown that characteristic substitutions, especially in HA1 allowed H1N2 viruses to partially escape antibody neutralisation. Following experiments with H1N1-, H3N2- and H1N2-infected cells and interacting Natural killer (NK) cells or their activating receptors NKp44 and NKp46 demonstrated that characteristic amino acid substitutions of wt H1N2 viruses were associated with reduced NK cell lysis of the H1N2-infected cells and reduced recognition by receptor NKp44. Genetic analysis showed that the M-gene segment of wt H1N2 viruses had a closer relationship to a second A/H3N2 strain, the A/Panama/2007/99 (H3N2) reference strain, whereas the other six gene segments were closely related to those of A/Moscow/10/99 (H3N2)-like viruses. Comparing the replication properties of two recombinant H1N2 viruses that could only be distinguished by their M-gene segment, viruses containing the A/Moscow-like M-gene segment replicated to higher virus titres. Therefore, the genetic complement out of three different strains did not lead to increased replication efficiency. Assuming that H1N2 viruses co-circulated in the human population over a longer period, it is likely that further reassortment events may have occured. We therefore generated a recombinant H1N2 virus containing the NA-gene of the A/Panama/2007/99 (H3N2)-like strain instead of A/Moscow/10/99 (H3N2). The reassortant virus containing A/Panama-NA-gene also replicated to increased virus titres. Thus, by replacing just one gene segment by a segment of a homologous strain, two reassortant viruses with increased replication properties compared to the `recombinant reference virus´ arose. For the first time, it was proved that a functional balance of H1-HA and N2-NA, good replication properties, antigenic drift and the ability of partial immune escape promoted the wide distribution of H1N2 viruses. The fact that they disappeared after two influenza seasons indicated, that their antigenic changes were not fast and distinct enough to escape the `herd immunity´ within the human population and co-circulate next to H1N1 viruses.