Molekularbiologische und biochemische Charakterisierung eines Adeninnukleotid- Translokator (ANT)-transgenen Tiermodells

Abstract

Der Adeninnukleotid-Translokator (ANT) ist eine zentrale Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels. Er ermöglicht den Austausch von zytosolischem ADP und mitochondrialem ATP über die innere mitochondriale Membran. Darüber hinaus ist der ANT ein essentieller Regulator der Apoptose. Herzerkrankungen wie Ischämie und Hypoxie sind mit einem gestörten Energiestoffwechsel und einer ANT-Dysfunktion verbunden. Dies führt zur Reduktion des intrazellulären ATP-Gehalts, zur Entstehung von oxidativem Stress und zum Zusammenbruch der zellulären Homöostase, was Nekrose und Apoptose auslöst. Im ersten Teil der Arbeit wurde daher analysiert, ob eine ANT1-Überexpression bei Hypoxie und Ischämie protektiv wirkt. Im Hypoxie- Modell wurden WT- und ANT1-neonatale Rattenkardiomyozyten (NRCM) für 24 h (akut) und 48 h (chronisch) hypoxischen Bedingungen ausgesetzt und in Bezug auf die zuvor genannten Veränderungen analysiert. Hypoxische WT-NRCM zeigten im Verlauf der Hypoxie einen stetig abnehmenden ATP-Gehalt, der in den ANT1-NRCM hingegen zunächst unbeeinflusst blieb und sich erst bei chronischer Hypoxie reduzierte. Darüber hinaus war die Produktion von Sauerstoffradikalen in den ANT1-NRCM signifikant geringer und parallel dazu wurde das antioxidative Stress-System nicht aktiviert. Ein stabilerer Energiemetabolismus und verminderter oxidativer Stress trugen zur Hemmung der Apoptose- und Nekrose in den ANT1-NRCM bei akuter und chronischer Hypoxie bei. Zudem mussten weitere Schutzmechanismen existieren, die die ANT1-NRCM effektiver vor Apoptose und Nekrose-Induktion schützten. Diese Studie zeigte, dass die zellprotektiv wirkenden Akt- und ERK1/2-Signalwege in den ANT1-NRCM verstärkt aktiviert waren. Auch wurde das Hitzeschockprotein 90, ein Chaperon und Stabilisator der aktiven Akt, verstärkt gebildet. Die Akt- und ERK1/2-Kinasen fördern das Überleben der Zelle durch Aktivierung anti- apoptotischer Zielproteine und Hemmung pro-apoptotischer Faktoren, wie die Initiator-Caspase-9, was die verminderte Aktivierung von Caspase-3/7 und die geringere DNA-Fragmentierung in ANT1-NRCM erklärt. Darüber hinaus aktivieren Akt und ERK1/2 den Transkriptionsfaktor HIF-1α, der das Überleben der Zellen sichert und in ANT1-NRCM vermehrt gebildet wurde. Insgesamt führen ein stabilerer Energiemetabolismus, geringerer oxidativer Stress sowie die massive Aktivierung von protektiven Akt- und ERK1/2-Signalwegen bei Hypoxie in ANT1-überexprimierenden NRCM zu einer erhöhten Resistenz gegen Apoptose- und Nekrose. Auch in vivo war ein deutlich positiver Effekt der ANT1-Überexpression zu beobachten. ANT1-Ratten zeigten bei myokardialer Ischämie eine höhere Überlebensrate, im Vergleich zum WT, nach Ligatur der linken proximalen Koronararterie. Die ANT1-Ratten besaßen zudem ein geringeres Infarktareal und einen unauffälligen Peroxidanteil im Blutserum sowie weniger Proteincarbonylierungen als Zeichen von vermindertem oxidativen Stress. Frühere Studien belegen, dass eine ANT1-Überexpression im Myokard unter pathophysiologischen Bedingungen die Myozytenstruktur und -funktion stabilisiert [50]. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die transgene ANT1-Überexpression schon unter basalen Bedingungen das kontraktile System und den Ca2+-Haushalt sowie die Morphologie der Kardiomyozyten beeinflusst. ANT1-Ratten exprimierten im Vergleich zum WT verstärkt kontraktile Proteine wie Myosin, Aktin und Troponin I sowie die Ca2+-ATPasen PMCA und SERCA2a im Myokard, die für den Ca2+-Rücktransport bei der Relaxation verantwortlich sind. Parallel dazu nahm die SERCA2a-Aktivität signifikant zu. Diese Protein- und Aktivitätsänderungen resultierten in einer zellulären physiologischen Hypertrophie und einer beschleunigten Kontraktilität von ANT1-adulten Rattenkardiomyozyten. Somit nimmt der ANT1 nicht nur Einfluss auf die mitochondriale Funktion und die Apoptose, sondern stabilisiert das kontraktile System [170], so dass dieses protektiv kontraktile Dysfunktionen kompensieren kann. Die kardiale ANT1-Überexpression beeinflusst basal und unter pathophysiologischen Bedingungen viele intrazelluläre Prozesse. Daher war es von besonderem Interesse, Substanzen zu identifizieren, die die ANT1-Genexpression regulieren. Für diese Untersuchungen wurde ein Reporterplasmid generiert, bei dem eine Luziferase unter der Kontrolle von Promotorelementen des murinen ANT1-Gens stand. Nach Transfektion in kardiale HL-1-Zellen erfolgte die Stimulation mit IL-1β, TGF-β1, TNFα und IL-4, die das Entzündungsgeschehen, die Zelldifferenzierung, Apoptose und den Energiestoffwechsel beeinflussen. Parallel dazu wurde die Wirkung der Stimulanzen auf die endogene ANT1-Genexpression in NRCM untersucht. Auf Transkriptionsebene regulierte nur IL-1β die ANT1-Expression herunter und bewirkt somit eine verminderte Stresstoleranz der Zellen. Zusammenfassend wirkt die ANT1-Überexpression unmittelbar auf die zelluläre Stressresistenz. Über den gezeigten Einfluss auf den Apoptoseprozess, die Signaltransduktion und die Kontraktilität erweist sich der ANT1 als zentrale Regulationsstelle im intrazellulären Geschehen.

The adenine nucleotide translocase (ANT) is a central component of the mitochondrial energy metabolism. It facilitates the exchange of cytosolic ADP and intramitochondrial ATP across the inner mitochondrial membrane and is also involved in the regulation of apoptosis. Heart diseases like ischemia and hypoxia are linked to a disturbed energy metabolism and ANT dysfunction that result into reduced ATP content, oxidative stress as well as cellular necrosis and apoptosis. In this study we analyzed, whether ANT1 overexpression has a protective effect against hypoxia and ischemia inducing cell damage. In the experimental model of hypoxia, WT and ANT1 neonatal rat cardiomyocytes (NRCM) were incubated under hypoxic conditions for 24 h (acute) and 48 h (chronic) and were analyzed regarding the previously mentioned intracellular changes. WT-NRCM showed a continuous decline in ATP content in the course of hypoxia, while ATP content remained unaffected in hypoxic ANT1-NRCM in the acute phase and declined later during chronic hypoxia. In addition, ROS production was delayed and measurably lower in hypoxic ANT1-NRCM than in treated WT cells. In parallel, expression and activity of anti-oxidative stress enzymes remained unchanged in ANT1-NRCM under hypoxic conditions. A stable ATP content and less oxidative Stress in ANT1-NRCM support cell stability and thus, contribute to inhibition of apoptosis and necrosis observed in these cells. Besides, further mechanisms were identified, to protect cells more efficient against destruction. Those mechanisms included the higher activation of cell protective Akt and ERK1/2 signalling pathways in hypoxic ANT1-NRCM, which was supported by elevated expression of Hsp90, a chaperone and stabilizer of Akt. Both, Akt and ERK1/2 exert anti-apoptotic functions by promoting inhibition of pro-apoptotic components like Bad and caspase-9. These anit-apoptotic effects might explain the reduced caspase-3/7 activity and DNA-fragmentation observed in ANT1-NRCM. Besides acting anti-apoptotic, both Akt and ERK1/2 promote activation of the transcription factor HIF-1α, which was enhanced in ANT1-NRCM and accounts for adaptation and survival of cells during hypoxia. Taken together, a stable ATP-content, less oxidative stress and massive activation of protective Akt and ERK1/2 signalling pathways during hypoxia in ANT1 overexpressing NRCM lead to a high resistance against apoptosis and necrosis. The protective effect of ANT1 overexpression was also evident in vivo. ANT1-rats exhibited a reduction in infarct size and a higher survival rate during myocardial ischemia than WT animals, after ligation of the left descending coronary artery. Oxidative stress, measured by serum peroxide concentration and myocardial protein carbonylation, was also significantly lower in ischemic ANT1-rats. Former studies reveal that myocardial ANT1 overexpression preserves cardiac structure and function under pathophysiological conditions [50]. To ascertain whether the contractile system is directly affected by ANT1 overexpression under basal conditions, we analyzed contraction and relaxation parameters, contractile protein expression, Ca2+-handling, and cell morphology in these animals. ANT1-rat hearts displayed a marked increase in contractile proteins like myosin, actin and troponin I, as well as the Ca2+-ATPases PMCA and SERCA2a, that are responsible for Ca2+ export during relaxation. In addition to SERCA2a protein, SERCA2a activity was significantly increased in ANT1-rat hearts. These structural and functional changes explain the cellular physiologic hypertrophy observed in isolated ANT1 adult rat cardiomyocytes and remarkably contribute to accelerated cardiac performance of these cells. Thus, ANT1 overexpression influences not only mitochondrial function, apoptosis and signal transduction. It also stabilises cardiac structure and function [170] and possesses a potency to compensate restricted cardiac contraction under pathophysiological conditions. As described above, cardiac ANT1 overexpression affects various intracellular processes. Therefore, it was of particular interest, to identify substances that regulate ANT1 gene expression. For these analyses, reporter plasmids were generated, containing a luciferase under the control of promoter elements of the murine ANT1 gene. After transfection of these plasmids in cardiac HL-1-cells, cells were incubated with IL-1β, TGF-β1, TNFα and IL-4. These cytokines influence inflammation, cell differentiation, apoptosis and cellular energy metabolisms. In addition, the impact of stimulants to endogenous ANT1 gene expression in NRCM was analyzed. We found out, that IL-1β downregulates ANT1 gene expression and consequently causes reduces stress tolerance of those cells in cardiac diseases. In conclusion, ANT1 overexpression directly affects cellular stress resistance. Due to impact on apoptosis, signal transduction and contractile system, ANT1 plays an essential role in the intracellular networks.