Neuroprotektion durch Alpha-Tocopherol und Hypothermie nach Sauerstoff- Glucose-Deprivation bei Neocortex-Gewebeschnitten neonataler Ratten

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der neuroprotektive Effekt von alpha- Tocopherol, Erythropoeitin, milder Hypothermie, kombinierter Anwendung von Hypothermie und alpha-Tocopherol nach Sauerstoff-Glucose-Deprivation an Neocortex-Gewebsschnitten sechs bis acht Tage alter Wistar-Ratten untersucht. Die Sauerstoff-Glucose-Deprivation wurde durch einen gleichzeitigen Wechsel der Begasung der Interfacekammer und des Perfusionsmediums sowie Glucose- freies Perfusionsmedium ausgelöst und dauerte 20 Minuten. Die Sauerstoff- Glucose-Deprivation (OGD) führte zu einer vollständigen Unterdrückung von stimulusinduzierten Feldpotentialen in den neokortikalen Gehirnschichten II und III. Nach Beginn der OGD konnte zunächst eine anoxische Depolarisation von etwa 9 mV sowie eine starke Abnahme der extrazellulären Calziumionenkonzentration nach einer Latenzzeit von etwa 12 Minuten beobachtet werden. Alpha-Tocopherol, das nach der OGD verabreicht wurde, konnte – im Vergleich zu unbehandelten Neocortexschnitten – die Erholung der evozierten Feldpotentiale verbessern sowie eine reduzierte Rate an Propidiumjodid- Fluoreszenzsignalen bewirken, welche als indirekter Hinweis auf eine verminderte Zellschädigung gewertet wurde. Der prozentuale Anteil der Erholung evozierter Feldpotentiale betrug 112 ± 9,9 % in der α-Tocopherol- Versuchsgruppe und 96 ± 4,7 % in der Erythropoietin-Versuchsgruppe. Dem standen 81 ± 5,9 % in der Kontrollgruppe gegenüber. Die Zelltodrate, kalkuliert anhand der Fluoreszenzsignalintensitäten, betrug 20 ± 2 % bei der α -Tocopherol-Versuchsgruppe sowie 11 ± 2,3 % in der Erythropoietin-Gruppe im Vergleich zu insgesamt 40 ± 2,3 % in der Gruppe ohne Intervention, wobei die Werte 150 Minuten nach einer Ischämiephase erhoben wurden. Die Kombination von alpha-Tocopherol mit geringgradiger Hypothermie, definiert als ein Temperaturabfall von 4 °C, wies einen ähnlichen neuroprotektiven Effekt auf. Dieser stellte sich als Erholung der evozierten Feldpotentiale (108 ± 6,9 %) sowie als Reduktion der Propidiumjodid-Fluoreszenz auf 18 ± 2 % dar. Zusammenfassend zeigte sich ein signifikanter protektiver Effekt bei jeder der einzelnen Interventionsgruppen. Im Trend schien die Anwendung von Erythropoietin, Hypothermie, Tocopherol sowie der Kombination Hypothermie / Tocopherol in aufsteigender Folge zu einer verbesserten Erholung am Ende der Beobachtungsphase zu führen. Es zeigte sich jedoch keine statistische Signifikanz. In den Leergruppen ohne Intervention und ohne Ischämie fand sich in der Gruppe Leer-Toco eine sehr hohe Erholungsrate nach 150 min, welches sich als protektiver Effekt der Tocopherolapplikation diskutieren lässt. Im Weiteren zeigte sich kein signifikanter Einfluss von α-Tocopherol, Alkohol und Erythropoietin auf die Erholungsrate am Ende der Beobachtungszeit. Die vorliegende Studie an neonatalen Neocortices von Ratten belegte einen neuroprotektiven Effekt von alpha-Tocopherol per se, als auch in Kombination mit geringgradiger Hypothermie, im Rahmen einer erfolgten Ischämie, wobei sowohl die funktionelle Erholung verbessert als auch die Zelltodrate entscheidend reduziert werden konnte.

The work at hand assesses the neuroprotecive effects of a-Tocopherol, Erythropoeitin, mild hypothermia and the combined use of hypothermia and a-Tocopherol on neocortex-slices of six to eight day old wistar-rats after moderate oxygen-glucose-deprivation. Oxygen-glucose-deprivation was induced by a switch of gas in the interface-chamber and the use of glucose-free perfusion-medium for twenty minutes. Oxygen-glucose-deprivation (OGD) lead to a complete suppression of stimulusinduced field-potentials in neocortical brain-layers II and III. After the onset of OGD we initially observed an anoxic depolarization of about 9 mV as well as a strong reduction of extracellular calcium-ion-concentration after a latency period of about 12 minutes. A-Tocopherol administered after OGD could – compared to untreated neocortex-slices – improve recovery of evoked field-potentials as well as reduce the rate of propidiumiodide-fluorescence-signals, which was perceived as an indirect indicator of attenuated cell-damage. The proportion of recovery of evoked field-potentials was 112 +/- 9.9% in the a-Tocopherol-treatment- group and 96 +/-4.7% in the erythropoietin-treatment-group compared to 81 +/- 5.9% in the control-group. The rate of cell-death, calculated by fluorescence- signal-intensity, was 20 +/-2% in the a-Tocopherol-treatment-group and 11+/- 2.3% in the erythropoietin-treatment-group as compared to 40 +/-2.3% in the control-group without an intervention. These measures were taken 150 minutes after a phase of ischemia. The combination of a-Tocopherol and mild hypothermia, defined as a temperature drop of 4 °C, demonstrated a similar neuroprotective effect. This was shown in a recovery of evoked field- potentials (108 +/- 6.9%) as well as a reduction of propidiumiodide- fluorescence to 18 +/- 2%. In summary we could demonstrate a significant neuroprotective effect in each of the intervention-groups. We observed a trend of progressive neuroprotective potential demonstrated by improved recovery at the end of the observation period using Erythropoietin, hypothermia, Tocopherol and the combination of hypothermia/Tocopherol in that order. This did not achieve statistical significance. In the control-groups without intervention and without ischemia there was an extremely high recovery-rate in the Tocopherol-group after 150 minutes, which could be discussed to be a protective effect of Tocopherol-application. Subsequently we could not show a significant impact of a-Tocopherol, alcohol and Erythropoietin on recovery- rate at the end of the observation-period. The study at hand on neocortices of neonatal rats demonstrated a neuroprotective effect of a-Tocopherol per se as well as in combination with mild hypothermia following an ischemic insult. In this context functional recovery was improved as well as the rate of cell- death significantly reduced.