Klonierung und Charakterisierung von antiidiotypischen IgG-Fab gegen ein thrombozytenbindendes IgG-Fab eines Patienten mit AITP

Abstract

Intravenös verabreichte Immunglobuline der Klasse G (IVIG), gewonnen aus dem Plasma zahlreicher gesunder Blutspender, werden seit vielen Jahren erfolgreich in der Therapie der autoimmunen Thrombozytopenie (AITP) und anderer Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Der Wirkungsmechanismus von IVIG erscheint komplex und ist noch nicht eindeutig geklärt. Es werden sowohl Fc-Rezeptor- vermittelte-Wirkungen, als auch immunmodulatorische antiidiotypische Effekte, ausgehend von den antigenbindenden Anteilen der Antikörper, den Fab-Fagmenten, diskutiert. Im Rahmen der Untersuchung der antiidiotypischen Effekte von IVIG auf das Immunsystem gelang der Arbeitsgruppe von PD Dr. Peter Fischer mithilfe der Phagen-Display-Technik und antiidiotypischem Biopanning auf IVIG erstmals die Klonierung und molekulare Analyse von thrombozytenbindenden IgG-Fab- Fragmenten von AITP-Patienten. Diese stammten überwiegend von der VH-4 Genfamilie ab. Betrachtete man jedoch alle nicht-thrombozyten-bindenden, IVIG- gebundenen Fab aus Autoimmun-Patienten und gesunden Probanden, ergab sich, dass die VH Keimbahn-Gensegmente 3-30 und 3-23 den häufigsten genetischen Ursprung der variablen Region der schweren Kette darstellten. Interessanterweise hatten die CDR3-Region und die leichten Ketten wenig Einfluss auf die Selektion durch IVIG, ebenso zeigte sich kein gehäuftes Auftreten bestimmter DH- und JH-Keimbahngensegmente. Die Tatsache, dass IVIG, unabhängig von einem bestimmten Krankheitsbild, bevorzugt Antikörper bindet, die ihren Ursprung in den VH Keimbahn-Genloci 3-30 und 3-23 haben, lässt auf eine grundlegende Bedeutung dieser Interaktion für die Regulation des B-Zell Repertoires schließen. Dies führt zu der Hypothese, dass IVIG neben der direkten Bindung von Autoantikörpern auch über eine B-Zell-Superantigen-artige Funktion auf die Regulation des B-Zell Repertoires einwirkt. Um genauere Aussagen über potentielle, regulatorische IVIG-Moleküle machen zu können und damit eine mögliche klinische Relevanz zu erreichen, war es Ziel der vorliegenden Arbeit, diejenigen Fab-Fragmente mithilfe der oben beschriebenen IVIG-Targets aus einer bereits in der Gruppe von PD Dr. Peter Fischer etablierten Fab-Phagen-Bibliothek eines gesunden Probanden (als Repräsentant für IVIG) zu klonieren, die die therapeutisch relevanten Moleküle aus IVIG darstellen. Eine anschließende strukturelle und funktionelle Charakterisierung sollte den antiidiotypischen Wirkungsmechanismus von IVIG näher beleuchten. Mittels der Phagen-Display- und Biopanning-Technik konnten Fab-präsentierende Phagenklone aus einer IgG-Bibliothek eines Gesunden kloniert werden, welche durch Reaktion mit einem thrombozytenbindenden Fab-Fragment der VH 3-30 Genfamilie (LO31) isoliert wurden. Vier der LO31-bindenden Fab-Phagenklone, die ein unterschiedliches BstNI-Restriktionsmuster aufwiesen, wurden sequenziert. Es zeigte sich, dass drei Klone identisch waren und von VH 4-61 und VL3r abstammten. Der vierte Klon hatte seinen genetischen Ursprung in den VH 1-02 und VL 2a2 Keimbahn-Gensegmenten. Ein Vergleich der gefundenen Sequenzen der beiden isolierten Klone auf DNA- und Proteinebene zeigte deutliche Unterschiede sowohl in den CDR-, als auch in den Gerüstregionen der Fab-Fragmente. Die CDR-Regionen unterschieden sich dabei nicht nur in ihren Aminosäuremustern, sondern zum Teil auch in ihrer Länge. Die durch den Vergleich mit den Keimbahngenen ermittelten Mutationsraten der CDR- und Gerüstregionen, sowie das ermittelte Verhältnis von Austausch-Mutationen zu stillen Mutationen, führten zu dem Schluss, dass die isolierten Fab-Fragmente durch antigen-gerichtete Mutationen der Keimbahngene entstanden waren. Um das Bindungsverhalten der LO31-bindenden Fab-Phagen zu charakterisieren, wurden lösliche Fab-Fragmente, die unterschiedliche Bindungspräferenzen aufwiesen und zum Teil in ihrem genetischen Ursprung variierten, aufwändig hergestellt und aufgereinigt. Bei sich anschließenden Bindungsversuchen wurde deutlich, dass die isolierten Fab-Phagen ausschließlich das Fab-Fragment spezifisch banden, über welches sie isoliert worden waren. Andere Fab-Fragmente wurden schwach oder gar nicht gebunden. Auch eine Bindung an Fc-Fragment war nicht nachweisbar. Die isolierten Fab-Fragmente waren demnach nicht in der Lage, eine Vielzahl von VH 3-30 bzw. VH 3-23 abstammenden Antikörpern zu binden. Zusammenfassend kann man sagen, dass es gelungen ist, zwei Fab-Fragmente aus einer IgG-Bibliothek eines gesunden Probanden zu isolieren, die mit den durch IVIG isolierten Fab sehr spezifisch/antiidiotypisch interagieren. Es handelt sich dabei aber nicht um die postulierte Teilmenge aus IVIG, die im Sinne eines B-Zell-Superantigens außerhalb der Antigen-Bindungsstelle an eine Vielzahl von B-Zell-Rezeptoren bindet, sondern um Antikörper, die als individuelle Idiotypen wahrscheinlich eher als Ak2 beta oder gamma binden. Die isolierten Fab-Fragmente, könnten daher jenen Antikörpern aus IVIG entsprechen, die gegen Thrombozyten gerichtete Autoantikörper blockieren und damit den mit der Bindung der Autoantikörper einhergehenden Abbau der Thrombozyten verhindern.

Since many years, intravenously administered IgG antibodies (IVIG) prepared from plasma of numerous healthy blood donors are successfully used in the therapy of autoimmune thrombocytopenia (AITP) and other autoimmune diseases. IVIG`s mechanism of action seems to be complex and is not clearly clarified yet. Both Fc-receptor dependent effects and immunmodulatory antiidiotypic effects based on the antigen-binding sites, the so called Fab fragments, were discussed to play a role. Applying phage display and antiidiotypic biopanning with IVIG to investigate the antiidiotypic effects of IVIG on the immune system, the group of PD Dr. Peter Fischer had cloned and characterized many platelet reactive human IgG Fab fragments from patients with AITP for the first time. The platelet reactive Fab fragments originated predominantly from the VH-4 germline gene family. However, the VH germline genes 3-23 and 3-30 represented the most frequent genetic origin of the variable region of the heavy chain regarding the platelet-negative, IVIG selected clones from autoimmune patients and from a healthy individual. Interestingly, the CDR3-region and the light chains seemed to have no influence on the selection by IVIG, likewise there was no accumulation of certain DH- and JH-germline genes. The fact that IVIG preferably bound antibodies originating from the germline gene segments 3-30 and 3-23 independent of a certain disease together with other results suggested a fundamental meaning of these interaction for the regulation of the B-cell repertoire. This led to the hypothesis that IVIG may regulate the B-cell repertoire over a B-cell-superantigen-like-function besides the direct binding of autoantibodies. In order to get more information about the potential regulating molecules of IVIG and to reach a possible clinical relevance it was the goal of this study to clone the therapeutically relevant molecules from IVIG. For that purpose the IVIG-targets described above and a Fab-Phage-library of a healthy donor (as representative for IVIG) which were already established by the group of PD Dr. Peter Fischer should be used. The structural and functional characterisation of the isolated clones afterwards should made the possible antiidiotypic mechanism of IVIG more clear. Fab presenting phage clones originating from an IgG library of a healthy individual and isolated by binding to a platelet reactive Fab fragment of the VH 3-30 gene family (LO31) isolated previously with IVIG could be cloned by means of phage display and biopanning technique. Sequencing of four LO31-binding Fab phage clones, which displayed a different BstNI restriction pattern, revealed the genetic identity of three clones originating from VH4-61 and VL2a2. The fourth clone showed a VH1-02 and VL2a2 germline gene origin. When sequences were compared at DNA and protein level a great variability of the CDRs as well as framework regions was revealed. The CDRs not only differed in their amino-acid patterns but also partially in their length. Determination of mutation rates from CDRs and framework regions by comparison with germline genes and the relation between replacement and silent mutations led to the conclusion that mutations of the germline genes were antigen driven. To characterise the binding properties of the LO31 binding Fab phages, soluble Fab fragments with differing binding specificities and partially differing genetic origin were large-scale produced and purified. Subsequent binding assays demonstrated that isolated Fab phages bound specifically to the Fab fragments by which they had been isolated. Other Fab fragments bound only weak or not at all. Binding to Fc fragment was not detectable. As a result, the isolated Fab fragments did not bind multiple VH3-30 or VH3-23 originating antibodies but were true antiidiotypic antibodies against a single antibody. In conclusion, two Fab fragments which interact highly specifically/antiidiotypically with a single IVIG-selected Fab were successfully isolated from an IgG library of a healthy individual. They did not represent the postulated subset from IVIG, representing a B cell superantigen, which binds outside of the antigen binding site to multiple B-cell receptors, but refers to antibodies, which - as individual idiotyps bind rather as Ab2 beta or gamma. The reason may have been the very restricted panning procedures. The isolated Fab fragments might represent antibodies from IVIG with thrombocyte autoantibody-blocking properties and hence inhibit the autoantibody caused destruction of the thrombocytes.