dc.contributor.author
Gluschke, Manuela
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:45:37Z
dc.date.available
2007-06-19T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1564
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5766
dc.description
Deckblatt-Impressum
persönlicher Dank
Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Zusammenfassung
Summary
Literaturverzeichnis
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
dc.description.abstract
Intravenös verabreichte Immunglobuline der Klasse G (IVIG), gewonnen aus dem
Plasma zahlreicher gesunder Blutspender, werden seit vielen Jahren erfolgreich
in der Therapie der autoimmunen Thrombozytopenie (AITP) und anderer
Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Der Wirkungsmechanismus von IVIG erscheint
komplex und ist noch nicht eindeutig geklärt. Es werden sowohl Fc-Rezeptor-
vermittelte-Wirkungen, als auch immunmodulatorische antiidiotypische Effekte,
ausgehend von den antigenbindenden Anteilen der Antikörper, den Fab-Fagmenten,
diskutiert. Im Rahmen der Untersuchung der antiidiotypischen Effekte von IVIG
auf das Immunsystem gelang der Arbeitsgruppe von PD Dr. Peter Fischer mithilfe
der Phagen-Display-Technik und antiidiotypischem Biopanning auf IVIG erstmals
die Klonierung und molekulare Analyse von thrombozytenbindenden IgG-Fab-
Fragmenten von AITP-Patienten. Diese stammten überwiegend von der VH-4
Genfamilie ab. Betrachtete man jedoch alle nicht-thrombozyten-bindenden, IVIG-
gebundenen Fab aus Autoimmun-Patienten und gesunden Probanden, ergab sich,
dass die VH Keimbahn-Gensegmente 3-30 und 3-23 den häufigsten genetischen
Ursprung der variablen Region der schweren Kette darstellten.
Interessanterweise hatten die CDR3-Region und die leichten Ketten wenig
Einfluss auf die Selektion durch IVIG, ebenso zeigte sich kein gehäuftes
Auftreten bestimmter DH- und JH-Keimbahngensegmente. Die Tatsache, dass IVIG,
unabhängig von einem bestimmten Krankheitsbild, bevorzugt Antikörper bindet,
die ihren Ursprung in den VH Keimbahn-Genloci 3-30 und 3-23 haben, lässt auf
eine grundlegende Bedeutung dieser Interaktion für die Regulation des B-Zell
Repertoires schließen. Dies führt zu der Hypothese, dass IVIG neben der
direkten Bindung von Autoantikörpern auch über eine B-Zell-Superantigen-artige
Funktion auf die Regulation des B-Zell Repertoires einwirkt. Um genauere
Aussagen über potentielle, regulatorische IVIG-Moleküle machen zu können und
damit eine mögliche klinische Relevanz zu erreichen, war es Ziel der
vorliegenden Arbeit, diejenigen Fab-Fragmente mithilfe der oben beschriebenen
IVIG-Targets aus einer bereits in der Gruppe von PD Dr. Peter Fischer
etablierten Fab-Phagen-Bibliothek eines gesunden Probanden (als Repräsentant
für IVIG) zu klonieren, die die therapeutisch relevanten Moleküle aus IVIG
darstellen. Eine anschließende strukturelle und funktionelle Charakterisierung
sollte den antiidiotypischen Wirkungsmechanismus von IVIG näher beleuchten.
Mittels der Phagen-Display- und Biopanning-Technik konnten Fab-präsentierende
Phagenklone aus einer IgG-Bibliothek eines Gesunden kloniert werden, welche
durch Reaktion mit einem thrombozytenbindenden Fab-Fragment der VH 3-30
Genfamilie (LO31) isoliert wurden. Vier der LO31-bindenden Fab-Phagenklone,
die ein unterschiedliches BstNI-Restriktionsmuster aufwiesen, wurden
sequenziert. Es zeigte sich, dass drei Klone identisch waren und von VH 4-61
und VL3r abstammten. Der vierte Klon hatte seinen genetischen Ursprung in den
VH 1-02 und VL 2a2 Keimbahn-Gensegmenten. Ein Vergleich der gefundenen
Sequenzen der beiden isolierten Klone auf DNA- und Proteinebene zeigte
deutliche Unterschiede sowohl in den CDR-, als auch in den Gerüstregionen der
Fab-Fragmente. Die CDR-Regionen unterschieden sich dabei nicht nur in ihren
Aminosäuremustern, sondern zum Teil auch in ihrer Länge. Die durch den
Vergleich mit den Keimbahngenen ermittelten Mutationsraten der CDR- und
Gerüstregionen, sowie das ermittelte Verhältnis von Austausch-Mutationen zu
stillen Mutationen, führten zu dem Schluss, dass die isolierten Fab-Fragmente
durch antigen-gerichtete Mutationen der Keimbahngene entstanden waren. Um das
Bindungsverhalten der LO31-bindenden Fab-Phagen zu charakterisieren, wurden
lösliche Fab-Fragmente, die unterschiedliche Bindungspräferenzen aufwiesen und
zum Teil in ihrem genetischen Ursprung variierten, aufwändig hergestellt und
aufgereinigt. Bei sich anschließenden Bindungsversuchen wurde deutlich, dass
die isolierten Fab-Phagen ausschließlich das Fab-Fragment spezifisch banden,
über welches sie isoliert worden waren. Andere Fab-Fragmente wurden schwach
oder gar nicht gebunden. Auch eine Bindung an Fc-Fragment war nicht
nachweisbar. Die isolierten Fab-Fragmente waren demnach nicht in der Lage,
eine Vielzahl von VH 3-30 bzw. VH 3-23 abstammenden Antikörpern zu binden.
Zusammenfassend kann man sagen, dass es gelungen ist, zwei Fab-Fragmente aus
einer IgG-Bibliothek eines gesunden Probanden zu isolieren, die mit den durch
IVIG isolierten Fab sehr spezifisch/antiidiotypisch interagieren. Es handelt
sich dabei aber nicht um die postulierte Teilmenge aus IVIG, die im Sinne
eines B-Zell-Superantigens außerhalb der Antigen-Bindungsstelle an eine
Vielzahl von B-Zell-Rezeptoren bindet, sondern um Antikörper, die als
individuelle Idiotypen wahrscheinlich eher als Ak2 beta oder gamma binden. Die
isolierten Fab-Fragmente, könnten daher jenen Antikörpern aus IVIG
entsprechen, die gegen Thrombozyten gerichtete Autoantikörper blockieren und
damit den mit der Bindung der Autoantikörper einhergehenden Abbau der
Thrombozyten verhindern.
de
dc.description.abstract
Since many years, intravenously administered IgG antibodies (IVIG) prepared
from plasma of numerous healthy blood donors are successfully used in the
therapy of autoimmune thrombocytopenia (AITP) and other autoimmune diseases.
IVIG`s mechanism of action seems to be complex and is not clearly clarified
yet. Both Fc-receptor dependent effects and immunmodulatory antiidiotypic
effects based on the antigen-binding sites, the so called Fab fragments, were
discussed to play a role. Applying phage display and antiidiotypic biopanning
with IVIG to investigate the antiidiotypic effects of IVIG on the immune
system, the group of PD Dr. Peter Fischer had cloned and characterized many
platelet reactive human IgG Fab fragments from patients with AITP for the
first time. The platelet reactive Fab fragments originated predominantly from
the VH-4 germline gene family. However, the VH germline genes 3-23 and 3-30
represented the most frequent genetic origin of the variable region of the
heavy chain regarding the platelet-negative, IVIG selected clones from
autoimmune patients and from a healthy individual. Interestingly, the
CDR3-region and the light chains seemed to have no influence on the selection
by IVIG, likewise there was no accumulation of certain DH- and JH-germline
genes. The fact that IVIG preferably bound antibodies originating from the
germline gene segments 3-30 and 3-23 independent of a certain disease together
with other results suggested a fundamental meaning of these interaction for
the regulation of the B-cell repertoire. This led to the hypothesis that IVIG
may regulate the B-cell repertoire over a B-cell-superantigen-like-function
besides the direct binding of autoantibodies. In order to get more information
about the potential regulating molecules of IVIG and to reach a possible
clinical relevance it was the goal of this study to clone the therapeutically
relevant molecules from IVIG. For that purpose the IVIG-targets described
above and a Fab-Phage-library of a healthy donor (as representative for IVIG)
which were already established by the group of PD Dr. Peter Fischer should be
used. The structural and functional characterisation of the isolated clones
afterwards should made the possible antiidiotypic mechanism of IVIG more
clear. Fab presenting phage clones originating from an IgG library of a
healthy individual and isolated by binding to a platelet reactive Fab fragment
of the VH 3-30 gene family (LO31) isolated previously with IVIG could be
cloned by means of phage display and biopanning technique. Sequencing of four
LO31-binding Fab phage clones, which displayed a different BstNI restriction
pattern, revealed the genetic identity of three clones originating from VH4-61
and VL2a2. The fourth clone showed a VH1-02 and VL2a2 germline gene origin.
When sequences were compared at DNA and protein level a great variability of
the CDRs as well as framework regions was revealed. The CDRs not only differed
in their amino-acid patterns but also partially in their length. Determination
of mutation rates from CDRs and framework regions by comparison with germline
genes and the relation between replacement and silent mutations led to the
conclusion that mutations of the germline genes were antigen driven. To
characterise the binding properties of the LO31 binding Fab phages, soluble
Fab fragments with differing binding specificities and partially differing
genetic origin were large-scale produced and purified. Subsequent binding
assays demonstrated that isolated Fab phages bound specifically to the Fab
fragments by which they had been isolated. Other Fab fragments bound only weak
or not at all. Binding to Fc fragment was not detectable. As a result, the
isolated Fab fragments did not bind multiple VH3-30 or VH3-23 originating
antibodies but were true antiidiotypic antibodies against a single antibody.
In conclusion, two Fab fragments which interact highly
specifically/antiidiotypically with a single IVIG-selected Fab were
successfully isolated from an IgG library of a healthy individual. They did
not represent the postulated subset from IVIG, representing a B cell
superantigen, which binds outside of the antigen binding site to multiple
B-cell receptors, but refers to antibodies, which - as individual idiotyps
bind rather as Ab2 beta or gamma. The reason may have been the very restricted
panning procedures. The isolated Fab fragments might represent antibodies from
IVIG with thrombocyte autoantibody-blocking properties and hence inhibit the
autoantibody caused destruction of the thrombocytes.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Autoimmune diseases
dc.subject
thrombocytopenia
dc.subject
thrombocytopenic purpura
dc.subject
intravenous injection
dc.subject
bacteriophages
dc.subject
molecular sequence data (MeSH)
dc.subject
immunoglobulins
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Klonierung und Charakterisierung von antiidiotypischen IgG-Fab gegen ein
thrombozytenbindendes IgG-Fab eines Patienten mit AITP
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Michael Schmidt
dc.contributor.furtherReferee
PD Dr. Peter Fischer
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Achim Gruber
dc.date.accepted
2007-04-26
dc.date.embargoEnd
2007-06-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002962-1
dc.title.translated
Antiidiotypic antibodies against a platelet reactive IgG Fab cloned from a
combinatorial antibody library of a healthy individual
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000002962
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2007/436/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000002962
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access