MicroRNA-34a regulates epithelial–mesenchymal transition (EMT) in cancer stem (like) cells (CSCs) of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and is a possible molecular target

Abstract

MicroRNAs (miRs) are short non-coding single-strand RNAs that regulate the translation of target mRNAs in normal and cancer cells. In the latter, they are frequently dysregulated, promoting tumor progression. Cancer stem cells (CSCs) are a small cell subset within a tumor that play a role in the genesis and progress of cancer. The relevance of epithelial-mesenchymal transition (EMT) has recently been recognized for tumor development and metastasis. Several studies have illustrated that miRs regulate EMT of CSCs. CSC from 8 squamous cell carcinoma of the head and neck (HNSCC) cell lines (4 HPV+, 4 HPV-) were enriched by spheroid culture (spheroid-derived cells, SDCs) and compared to their parental monolayer-derived cells (MDCs) to analyze possibly distinct expression patterns of miR-34a, CSC-related transcription factors (CSC-TFs: Sox2, Nanog, Oct3/4) and EMT-related TFs (EMT-TFs: Twist, Snail1, Snail2) by RT-qPCR. FACS and FACS-sorting was used to quantify and enrich for ALDH+ CSCs. Transfection of miR-34a mimics was used to evaluate the regulatory role of miR-34a for CSC marker profiles as well as CSC- and EMT- TF expression in HNSCC-SDCs. The invasion, colony-forming and clonogenic capability of the SDCs, which were transfected with miR-34a mimics after sorting for ALDH+ and ALDH- cells, was assessed by matrigel invasion, clonogenicity- and spheroid- formation assay, respectively. miR-34a expression levels were significantly downregulated in the majority of SDCs derived from HNSCC cell lines as compared to parental MDCs (-1.61 to 16.37 fold, P＜0.05). For EMT- and CSC- related TF expression, all HNSCC-derived SDCs showed a significantly increased level compared to parental MDCs (1.04 to 36.81 fold, P＜0.05). Increased expression of ALDH was found in SDCs (2 to 3 fold, P＜0.05). Compared to the HPV+-, the HPV- group (n=4) showed a significantly higher expression level of EMT-TFs, CSCs-TFs, and the CSC marker ALDH (30.33% vs. 12.83%, P＜0.05). Transfection of miR-34a mimics significantly reduced the EMT and CSC-related TF expression level in UM-SCC9 (HPV-) and UM-SCC47 (HPV+) SDCs. Simultaneously, the ALDH expression was reduced (1.5 to 2 fold, P＜0.05) and the invasive capacity and clonogenicity of HNSCC-SDCs was also inhibited by transfection of miR-34a mimics compared to controls. Restoration miR-34a significantly inhibited the capability for EMT, formation of CSC-phenotype and functionally reduced clonogenic and invasive capacity in HNSCC cell lines. Therapeutic modulation of miR-34a in HNSCC and CSCs may reduce the rate of metastasis and recurrence of tumors after therapy.

MicroRNAs (miRs) sind kurze nicht-kodierende, einzelsträngige RNAs, die die Translation von Ziel-mRNAs in normalen- und Krebszellen regulieren. In letzteren sind sie häufig fehlreguliert und fördern die Tumorprogression. Krebsstammzellen (CSCs) sind eine kleine Untergruppe von Zellen im Tumor, die eine Rolle bei der Entstehung und dem Progress von Krebs spielen. Die Bedeutung der Epithelial-Mesenchymalen-Transition (EMT) für die Tumorentwicklung und Metastasierung wurde vor kurzem erkannt. Mehrere Studien haben illustriert, das miR den EMT von CSC regulieren. Aus 8 Plattenepithelkarzinom- (HNSCC-) Zelllinien (4 HPV+, 4 HPV-) wurden CSC durch Spheroidkulturen angereichert (spheroid-derived cells, SDCs) und mit ihren Mutterzelllinien verglichen, um die möglicherweise unterschiedlichen Expressionsmuster von miR-34a, CSC-Transkriptionsfaktoren (TF; CSC-TFs: Sox2, Nanog, Oct3/4) und EMT-TF (EMT-TF: Twist, Snail1, Snail2) durch RT-qPCR zu analysieren. FACS und FACS-Sortierung wurde zur Quantifizierung und Anreicherung von ALDH+ CSCs verwendet. Die Transfektion von miR-34a-Mimics wurde verwendet, um die regulatorische Rolle von miR-34a auf CSC-Markerprofile und CSC- und EMT-TF-Expression in HNSCC-SDCs zu evaluieren. Die Fähigkeit zur Invasion, Klon- und Koloniebildung von SDCs, die mit miR-34a-Mimics nach Sortierung von ALDH+- und ALDH- Zellen wurde durch Matrigelinvasion-, Klonogenizitäts- and Spheroidbildungstests geprüft. Die miR-34a-Expression war in der Mehrheit der SDCs aus HNSCC im Vergleich zu parentalen MDCs signifikant (-1.61 bis 16.37-fach, P＜0.05) herabreguliert. Die EMT- und CSC-TF-Expression zeigte ein im Vergleich zu MDCs in allen HNSCC-SDCs ein signifikant erhöhtes Expressionsniveau (1.04 bis 36.81-fach, P＜0.05). Eine erhöhte Expression von ALDH wurde in SDCs nachgewiesen (2 bis 3-fach, P＜0.05). Verglichen zu der HPV+- zeigte die HPV- -Gruppe (n=4) eine signifikant höhere Expression von EMT-TFs, CSCs-TFs und dem CSC-Marker ALDH (30.33% versus 12.83%, P＜0.05). Die Transfektion von miR-34a-Mimics reduzierte signifikant die EMT- und CSC-TF- Expression von UM-SCC9 und UM-SCC47 SDCs. Gleichzeitig war die ALDH-Expression reduziert (1.5 bis 2-fach, P＜0.05) und die Invasionsfähigkeit und Klonbildungsfähigkeit von HNSCC-SDCs durch Transfektion von miR-34a-Mimics verglichen zu Kontrollen gehemmt. Eine Wiederherstellung von miR-34a-Spiegeln hemmte signifikant die Fähigkeit zur EMT, Ausbildung des CSC-Phänotyps und reduzierte funktionell die Fähigkeit zu Klonbildung und Invasion in HNSCC- Zellen. Eine therapeutische Modulation von miR-34a in HNSCC und CSC könnte die Rate von Metastasen und die Rezidivrate von Tumoren nach Therapie reduzieren.