siRNA-nanocarriers induce fluorescent protoporphyrin-IX by silencing of ferrochelatase: a new tool for tumor imaging

Abstract

Background: Selective and endogenous accumulation of Protoporphyrin IX (PpIX), a fluorescent precursor of heme, is one of the early events associated with the development of human carcinomas. Previous investigations of our group demonstrated preferential accumulation of PpIX in gastrointestinal malignant tissues. However, the reason for this accumulation has not been clarified yet. PpIX-mediated fluorescent imaging might be a new approach for visualization of early cancers. Results: A significant down-regulation of ferrochelatase (FECH) expression in gastric, colonic, and rectal carcinomas was determined by quantitative RT-PCR of human tissue samples. Experimentally-induced knock down of FECH expression in LS174T cells by using RNA-interference (RNAi) technique led to an accumulation of PpIX of more than 20-fold compared to untreated cells. Similarly, silencing of FECH in MDA MB 435 cells showed a considerable enhancement of PpIX accumulation. Incubation of LS174T cells with the substrate of heme-synthesis, aminolevulinic acid (ALA) in a concentration of 0.1 mM did not induce significant accumulation of PpIX. However, if cells were treated with siRNA followed by ALA, a dramatic enhancement of PpIX accumulation by a factor of 50 was achieved compared to cells treated only with ALA. These findings were further confirmed by in vivo experiments in nude mice xenotransplanted with human mammary carcinoma cell lines. Application of a single dose of 5mg/kg ALA alone did not result in sufficient fluorescence for in vivo detection of the xenografted tumors. However, if mice were treated with siRNA followed by ALA, PpIX-dependent fluorescence hotspots were detected at the sites of the millimeter-sized tumors in nude mice. Conclusion: Functional application of siRNA alone leads to a dramatic enhancement of PpIX accumulation in colorectal cancer cells and human mammary carcinoma cells, supporting the hypothesis that down-regulation of FECH expression plays a crucial role for selective accumulation of PpIX in cancerous tissues. In vivo application of siRNA-based inhibitor of FECH in conjunction with a very low dose of ALA leads to a significantly higher endogenous PpIX level at the site of the xenografted tumor, which provides a promising new modality for detecting the millimeter-sized tumor in the mouse model. Either siRNA encapsulated within folate-PEG cationic liposomes or bound to polyglycerol- based nanocarriers worked well in this regard. This approach may facilitate early tumor diagnosis. Moreover, it may pave the way to a new kind of specific photodynamic therapy for cancerous diseases as the routinely applied high concentrations of ALA which have a number of undesired side effects can be reduced by using FECH-siRNA.

Einführung: Während der Entwicklung verschiedener Karzinome zeigt sich bereits früh eine selektive und endogene Anhäufung des fluoreszenten Vorläufermoleküls von Häm, des Protoporphyrin IX (PpIX), im Tumorgewebe. Der Nachweis der durch PpIX ausgelösten Fluoreszenz könnte daher als eine neue Methode zur Diagnose früher Tumorstadien verwendet werden. Allerdings ist bisher nicht geklärt, was die erhöhte PpIX Fluoreszenz in Karzinomen induziert. Resultate: Quantitative RT-PCR Untersuchungen zeigten eine Minderexpression der Ferrochelatase (FECH), eines wichtigen Enzyms der Hämsynthese, das die Bildung von PpIX au Häm katalysiert, in Magen-, Kolon- und Rektumkarzinomen. Nach Einsatz der RNA- Interferenz-Technik mit siRNA zum Knock-down der FECH-Expression in LS174T kolorektalen Zellen war eine um das 20-fache erhöhte Fluoreszenz der PpIX nachweisbar. Dies konnte in vergleichbaren Versuchen auch für MDA- MB-435-Zellen gezeigt werden. Wurden die Zellen außerdem zusätzlich zur FECH- siRNA mit dem Substrat der Hämsynthese, der Aminolävulinsäure (ALA), behandelt, konnte eine dramatische Erhöhung der PpIX-Anhäufung um einen Faktor 50 im Vergleich zu Zellen, die nur mit ALA behandelt wurden, erreicht werden. Diese in-vitro-Ergebnisse wurden inzwischen in in-vivo-Experimenten bestätigt. Eine kombinierte Behandlung von xenotransplantierten Mäusen mit einer in Folat-PEG-kationischen Liposomen verpackten oder an Dendritic-Polyglycerol- kationischen gebundenen FECH-siRNA zusammen mit ALA ermöglichte den Nachweis von millimetergroßen Karzinomen der Nackt-Mäuse anhand der PpIX-abhängigen Fluoreszenz bei 630 nm nach Bestrahlung mit Laserlicht der Wellenlänge 405 nm. Weder eine Behandlung mit siRNA oder ALA allein führte zu vergleichbaren Fluoreszenzemissionen. Schlussfolgerung: Eine experimentell induzierte Minderexpression des Ferrochelatase-Enzyms führt zu einer dramatischen Erhöhung der PpIX-Fluoreszenz in verschiedenen Tumorzelllinien. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass die Minderexpression der Ferrochelatase die beobachtete endogene PpIX-Fluoreszenz in humanen Karzinomen verursacht. Die in-vivo-Versuche zeigen, dass eine Gabe von FECH siRNA in Verbindung mit einer sehr geringen Dosis von ALA verwendet werden kann, um millimetergroße Karzinome im Maus-Modell zu identifizieren. Neben den diagnostischen Möglichkeiten, die sich daraus eröffnen, könnte diese Methodik den Weg zu einer neuen Art der photodynamischen Therapie von Karzinomen ebnen, bei der die Dosis an ALA sehr gering gehalten werden kann, um unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden.