dc.contributor.author
Visan, Anke
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:41:31Z
dc.date.available
2012-05-18T09:01:53.144Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1462
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5664
dc.description.abstract
Die Arbeit hatte zum Ziel, den Embryonalen Stammzelltest (EST) durch die
Etablierung von molekularen Endpunkten weiter zu entwickeln. In Vorversuchen
wurden molekulare Endpunkte für die Erfassung der
Herzmuskelzelldifferenzierung geprüft. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in
der Etablierung eines Protokolls basierend auf einem neuen Endpunkt zur
Erfassung von Substanzeffekten auf die neuronale Differenzierung sowie in der
Charakterisierung der sich differenzierenden neuralen Zellen. Zunächst konnte
gezeigt werden, dass die Differenzierung zu Herzmuskelzellen anhand der Marker
für die skelettalen Muskelzellproteine MHC (myosin heavy chain) und α-Actinin
immunfluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen und im Durchflusszytometer
quantitativ erfasst werden kann. Anhand einer Zeitanalyse über 20 Tage wurde
festgestellt, dass der optimale Zeitpunkt für die Messung der beiden
intrazellulären Proteinmarker der Tag 7 der Differenzierung ist. Die neuen
molekularen Endpunkte wurden anhand von drei in der Validierungsstudie
klassifizierten Substanzen 5-Fluorouracil, all-trans Retinsäure und Penicillin
G mit dem validierten Endpunkt, der mikroskopischen Erfassung der
Herzmuskelzell-kontraktionen, verglichen. Bei der Ermittlung der ID50-Werte
für die 50%ige Hemmung der Differenzierung wurden gut übereinstimmende
Ergebnisse erzielt. Für die Optimierung eines Protokolls zur neuralen
Differenzierung wurden insbesondere die Einflussfaktoren Zellzahl,
Mediumzusammensetzung und Beschichtungsform untersucht. Zunächst wurden die D3
Zellen auf Gelatine-beschichteten Zellkulturplatten differenziert, auf Basis
dessen die meisten Substanztestungen durchgeführt wurden. Über die Zeit
führten weitere Optimierungsschritte zu einem Protokoll, bei dem die Zellen
auf Poly-L-Ornithin- (PLO)-beschichteten Platten unter Zugabe von Laminin
differenziert wurden. Damit konnte nachweislich der Anteil an differenzierten
Neuronen in der Kultur erhöht werden. Anhand beider Protokollvarianten wurde
gezeigt, dass die mES Zellen während der voranschreitenden Differenzierung
eine zeitlich gestaffelte Entwicklung durchlaufen, beginnend mit der
Proliferation neuraler Vorläuferzellen bis hin zur Bildung reifer Neuronen und
Gliazellen. Dies wurde anhand von zelltypischen Markern für Vorläuferzellen,
Neuronen und Gliazellen immunfluoreszenz-mikroskopisch dokumentiert. Mit Hilfe
von durchflusszytometrischen Analysen gelang es neuronale und gliale Proteine
anhand der Marker Mikrotubulin-assoziiertes Protein 2 (MAP2), ß-Tubulin III,
α-Internexin, saures gliale Faserprotein (GFAP) und 2',3'-zyklisches Nukleotid
3'-Phophodiesterase (CNPase) über die Zeit von 30 Tagen zu quantifizieren. Der
Nachweis von synaptischen Vesikeln und Neurotransmittern lieferte zudem
Hinweise auf die Entwicklung funktional ausgereifter Neuronen und Gliazellen.
Des Weiteren reagierten die differenzierten Zellen auf die Stimulierung mit
Neurotransmitter bzw. deren Agonisten spezifisch mit einem Anstieg an
intrazellulärem Ca2+, was auf die Ausbildung von Glutamat- und Dopamin-
spezifischen Rezeptoren schließen lässt. Die quantitativen Untersuchungen
zeigten, dass die Neuronen anhand des Markers MAP2 am Tag 12 der
Differenzierung standardisiert erfasst werden können. Anhand von Substanztests
mit 5-Fluorouracil, Penicillin G, Lithiumchlorid, Valproinsäure und
Methylazoxymethanolacetat wurde demonstriert, dass durch die Bestimmung dieses
Endpunktes in den meisten Fällen reproduzierbare Konzentrations-Wirkungskurven
erzeugt werden können. Im Vergleich zu den Daten, die bei der Erfassung der
Zellviabilität im MTT-Test erhoben wurden, zeigte es sich, dass der ID50-Wert
für die Differenzierung mit dem IC50-Wert, dem Wert für die 50%ige Hemmung der
Viabilität der sich differenzierenden Zellen, in den meisten Fällen
zusammenfällt. Bei Lithiumchlorid war aufgrund der abweichend niedrigeren
ID50-Werte ein spezifischer Effekt auf die Differenzierung von MAP2-positiven
Neuronen zu erkennen. Anhand der Untersuchung von Valproinsäure konnte
zusätzlich gezeigt werden, dass sowohl bei der Differenzierung der Zellen nach
dem Gelatine- als auch nach dem PLO-Protokoll, gleiche ID50- und IC50-Werte
erzielt wurden.
de
dc.description.abstract
The aim of this work was to improve the Embryonic Stem Cell Test (EST) further
by establishing predictive molecular endpoints. Preliminary investigations
were made to establish molecular markers in order to substitute the visual
determination of the cardiac differentiation. The focus of this work was to
develop a new molecular endpoint for measuring developmental neurotoxicity.
For this purpose it was necessary to optimize a protocol for neural
differentiation which is adequate for substance testing and also to
characterize the differentiated neural cells. Applying immunofluorescence
microscopy for qualitative and flow cytometry for quantitative analysis it has
been shown that the skeletal proteins myosin heavy chain (MHC) and α-actinin
are sensitive markers for the detection of myocardial differentiation. A 20
day quantitative analysis of the differentiation demonstrated, that both
intracellular protein markers could be best monitored on day 7 of cultivation.
With three substances previously tested in the EST validation study -
5-fluorouracil, all-trans retinoic and penicillin G - it was shown that
comparable ID50 (concentration of half maximal inhibition of differentiation)
values can be obtained using the molecular endpoints. In order to optimize a
protocol for neural differentiation suitable for chemical testing, the main
focus was determining the effect of the parameters cell count, medium
composition and surface coating. First the cells were differentiated on
gelatin-coated cell culture dishes, which most of the substance tests are
based on. Further investigations led to the development of a poly-l-ornithin
(PLO) based protocol supplemented with laminin, which enhanced the proportion
of neurons in the differentiated culture. With both protocols it was shown,
that the differentiation is a time-dependent, graduated developmental process
which started with the proliferation of neural precursor cells and ended with
the generation of mature neurons and glial cells. This was monitored, using
immunofluorescence microscopy, by typical specific protein markers of
precursor cells, neurons and glial cells. Using the markers microtubule-
associated protein 2 (MAP2), ß-tubulin III, α-Internexin, glial fibrillary
acidic protein (GFAP) and 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase
(CNPase), neurons and glial cells were also quantified by flow cytometry
analysis until day 30 of differentiation. The presence of presynaptic vesicles
and neurotransmitters indicated functional maturation of the differentiated
cells. It was also shown, that the differentiated cells responded to different
agonists of glutamate and dopamine receptors with temporary increases of
intracellular Ca2+-levels. Quantitative investigations demonstrated that
neurons were best detected with the protein marker MAP2 on day 12 of the
differentiation. To evaluate the applicability of the endpoint, the substances
5-fluorouracil, penicillin G, lithium chloride, valproic acid and
methylazoxymethanolacetate were examined applying flow cytometry analysis.
Most of the tests showed reproducible concentration-response curves. When
compared to the effect on cell viability recorded in the MTT-cytotoxicity
assay it was shown, that the ID50 value for differentiation is mostly similar
to the IC50 value for the half maximal inhibition of viability of all
differentiating cells in culture. With lithium chloride, a specific effect was
detected on the differentiating MAP2-positive neurons. Using valproic acid it
was shown that both differentiation protocols (gelatin and PLO-protocol)
generated identical ID50 and IC50 values.
en
dc.format.extent
IX, 134, 8 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Embryonic Stem Cell Test
dc.subject
molecular endpoints
dc.subject
neural differentiation
dc.subject
in vitro developmental neurotoxicity testing
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Analyse der Differenzierung von Herzmuskelzellen und neuralen Zellen zur
Weiterentwicklung des Embryonalen Stammzelltests (EST)
dc.contributor.contact
a.visan@gmx.de
dc.contributor.firstReferee
Frau Prof. Dr. Monika Schäfer-Korting
dc.contributor.furtherReferee
Herr Prof. Dr. Horst Spielmann
dc.date.accepted
2012-03-16
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000037471-0
dc.title.translated
Analysis of the differentiation of myocardial and neural cells for the
enhancement of the Embryonic Stem Cell Test (EST)
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000037471
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000011065
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access