Kristallographische Studie zum Gewebsfaktor (Tissue Factor), dem Kofaktor von Faktor VIIa

Abstract

Gewebsfaktor (Tissue Factor, TF) ist als Kofaktor von Faktor VIIa (F.VIIa) an der Aktivierung des extrinsischen Systems der Blutgerinnungskaskade beteiligt. TF ist ein integrales Membranprotein, das aus einer extrazellulären Domäne (Aminosäuren 1-219), einer Transmembrandomäne (220-242) und einer zytoplasmatischen Domäne (243-263) zusammengesetzt ist. Sequenziell und strukturell gehört TF zur Familie der Zytokin-Rezeptoren. Gegenstand dieser Arbeit waren Kristallisationsstudien an TF. Für die Kristallisation standen Proteinlösungen von TF-219, TF-243, TF-263 sowie Biofeuchtmasse von der Mutante TF-263 C245S und die Fab-Fragmente des murinen D3- und des humanisierten D3H44-Antikörpers zur Verfügung. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Kristallisation von full length-TF als Modell für einen Zytokin-Rezeptor. Die Struktur eines full length-Zytokin-Rezeptors ist bislang nicht gelöst worden. Da es sich bei full length-TF um ein solubilisiertes Membranprotein handelt, erwies sich die Kristallisation als schwierig. Als Ergebnis dieser Arbeit können somit nur Kristalle präsentiert werden, die entweder zu klein sind, um sie weiter kristallographisch zu untersuchen, oder die bei ausreichender Größe nur ein Streuvermögen bis 7 Å zeigten. Das Ergebnis dieser Studie läßt weitere Möglichkeiten zur Verbesserung der Kristalle erkennen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden (1) die Strukturen der beiden anti-TF Fab-Fragmente des murinen D3- und des humanisierten D3H44-Antikörpers gelöst, miteinander verglichen und bezüglich der strukturbiologischen Aspekte des Humanisierungsprozesses beurteilt, sowie (2) die Antigen-Antikörper-Bindung des Komplexes zwischen D3H44 und TF-219 untersucht und Modifizierungen von D3H44 vorgeschlagen, die zu einer höheren Bindungsaffinität führen könnten. Die Kristallstruktur des murinen D3 Fab- Fragments ist mit einer Auflösung von 2,4 Å gelöst worden, die des humanisierten Fab-Fragments D3H44 mit 1,85 Å und die des Komplexes zwischen der extrazellulären Domäne von TF und D3H44 mit 1,85 Å. Der Vergleich der Struktur des murinen D3 mit der des humanisierten D3H44 zeigt, daß trotz verschiedener Antikörper-Gerüste nur geringe Unterschiede vorliegen. Die C?-Atome überlagern sich mit einer Abweichung von 1,27 Å (RMS, root-mean- square). Während des Humanisierungsprozesses von D3H44 sind 7 Aminosäuren im Antikörper-Gerüst und 6 Aminosäuren in den Bindungsschleifen (CDRs) ausgetauscht worden, um die Komplementarität der Bindungsstelle wiederherzustellen bzw. zu verbessern. Dabei konnte eine 100-fach bessere Bindung an TF im Vergleich zu der des murinen D3 Fab-Fragments erreicht werden. Die wichtigste Mutation, die nach der Kombination des humanen Antikörper-Gerüstes mit den murinen CDRs eine TF-Bindung gewährleistete, war Arg-H71-Ala. Die große Seitenkette von Arginin behindert sterisch die Ausbildung der Konformation von CDR-H1 und -H2, die zur TF-Bindung notwendig ist. Andere Substitutionen verbessern den hydrophoben Kontakt zwischen leichter und schwerer Kette oder führen zu direkten Wasserstoffbrücken zwischen den Bindungsschleifen, die zuvor nur durch Wassermoleküle vermittelt wurden. Die Kristallstrukturen des D3H44 Fab-Fragments mit 1,85 Å Auflösung, der Komplex TFD3H44 mit 1,85 Å Auflösung und die bereits publizierte Struktur des freien TF mit 1,7 Å Auflösung bieten die Möglichkeit, den Antigen- Antikörper-Erkennungsprozeß im Detail zu untersuchen. Die strukturellen Änderungen in D3H44 durch Komplexbildung mit TF sind gering und beschränken sich hauptsächlich auf die Umorientierung von Seitenketten. Die Kontaktfläche von TF und D3H44 zeichnet sich durch eine große Anzahl polarer Interaktionen aus. Zusätzlich sind 46 Wassermoleküle in diesem Kontaktbereich lokalisiert. In der Protein-Datenbank sind derzeit nur zwei weitere Systeme von Kristallstrukturen von Antigen-Antikörper-Komplexen und der freien Komponenten mit vollständigen Koordinaten verfügbar, die eine vergleichbare Auflösung aufweisen, nämlich Cytochrom c mit FabE8 sowie Lysozym mit dem Fab-Fragment HyHEL-63. Eine neue Auswertung dieser Strukturen nach den für die TF·D3H44-Struktur verwendeten Kriterien zeigt, daß diese Antigen-Antikörper- Komplexe Ähnlichkeiten aufweisen bezüglich (1) der Wassermoleküle im Kontaktbereich, (2) der Anzahl Wassermolekülen, die in einer freien Komponente und im Komplex gefunden werden, und (3) der Anzahl an Wassermoleküle, die nach der Komplexbildung durch polare Atome des Bindungspartners ersetzt werden.

Tissue Factor (TF) is a cofactor of Factor VIIa (F.VIIa) and is involved in the initiation of the extrinsic pathway of the blood coagulation cascade. TF is an integral membrane protein consisting of an extracellular domain (amino acids 1-219), a transmembrane domain (220-242), and a cytoplasmic domain (243-263). Based on structural and sequence similarities, TF belongs to the cytokine receptor superfamily. Here, TF is studied using protein crystallography. For these experiments, purified protein solutions were available for TF-219, TF-243, TF-263, the murine anti-TF Fab fragment D3, the humanised anti-TF Fab fragment D3H44, and cell paste for the mutant TF-263 C245S. The first part of this study addressed the crystallization of full- length TF, in order to obtain a model mimicing a full length cytokine receptor. So far, no structure of an integral cytokine receptor has been solved. Crystallization of the solubilized membrane proteins has proven difficult in the past, and also in this study the structure of full-length TF could not be solved. The crystals obtained were either too small for diffraction studies, or diffraction was limited to 7 Å only. In the second part of this study, the crystal structures of the anti-TF Fab fragments murine D3 and humanised D3H44 were solved and compared to study the structural aspects of the humanisation process. In addition, the antigen-antibody recognition process between TF and D3H44 was investigated. The crystal structure of the murine D3 Fab fragment was solved at a resolution of 2.4 Å. The structure of the humanised D3H44 antibody could be determined at a resolution of 1.85 Å, as well as the structure of the complex between the extracellular domain of TF and D3H44 at a resolution of 1.85 Å. The comparison between the structures of the murine D3 and the humanised D3H44 revealed only small deviations between these structures despite different antibody frameworks. The C? atoms can be superimposed with a deviation of 1.27 Å (RMS, root-mean-square). During the humanisation process 7 amino acids from the antibody framework and 6 amino acids from the complementarity determining regions (CDR) have been mutated with the result of a 100-fold increased binding affinity compared to the D3 antibody. The most important mutation was the exchange Arg-H71-Ala in order to reinduce TF binding. The large side-chain of arginine sterically hinders the conformation of the CDR-H1 and -H2 loops which is necessary for TF binding. Further substitutions optimize either the hydrophobic contact between the light and the heavy chains or introduce new hydrogen bonds between the binding loops replacing water-mediated contacts. The accessibility of the crystal structures of the D3H44 Fab fragment at 1.85 Å resolution, of the complex TFD3H44 at 1.85 Å resolution and the previously published structure of the free TF at 1.7 Å resolution offers a unique opportunity to study the antigen-antibody recognition process. The conformational changes in D3H44 induced during complex formation are small and are mainly restricted to the reorientation of side-chains. The combining site in the TFD3H44 complex contains a large number of polar interactions. In addition, 46 water molecules participate in the interface. In the Protein Data Bank, there are only two additional structures of antigen-antibody complexes for which the coordinates have been deposited together with the structures of the corresponding free antigen and free antibody. Structures at similar resolution are cytochrome c in complex with FabE8 and lysozyme in complex with HyHEL-63. Revisiting their antigen combining sites and applying the same criteria as for the TF·D3H44 structure shows that these antigen-antibody complexes are quite similar with respect to the number of water molecules in the interface, the number of identical water molecules in the free components and the complex, and the number of water molecules, which are expelled by polar atoms of the binding partner.