Tumor promoting functions of cellular telomerase RNA and viral RNAs in herpesvirus-induced cancer formation

Abstract

Marek's disease virus (MDV) is a highly oncogenic alphaherpesvirus that causes deadly lymphomas in chickens. MDV encodes a viral telomerase RNA (vTR) that is highly expressed during all stages of the virus life cycle. vTR is crucial for efficient MDV-induced lymphoma formation, however, the mechanism is not completely understood. Despite the high sequence identity between vTR and the cellular telomerase RNA (chTR) of 88%, it remains elusive if the overexpression of the chTR can contribute to cellular transformation. Intriguingly, TRs and Epstein- Barr virus (EBV) encoded RNAs (EBER-1 and EBER-2) have interaction partners in common that are highly conserved in humans and chickens. EBERs are the most abundant viral transcripts in EBV- induced tumor cell. However, their role in tumor development is still controversial. In the first part of the study, we wanted to investigate if the overexpression of cellular TRs (chTR) have tumor-promoting functions using a natural virus-host animal model of herpesvirus tumorigenesis. We initially deleted vTR (vΔvTR) in the RB-1B genome, a very virulent MDV strain, and subsequently inserted chTR at the vTR locus resulting in vchTR, using the Two- step Red-mediated mutagenesis system. The expression levels of vTR and chTR (in vchTR) were confirmed using qRT-PCR. chTR expression levels in vchTR were comparable to vTR in the wild-type. Neither the vTR-deletion nor the chTR insertion effected the MDV replication properties in vitro and in vivo. Intriguingly, the tumor formation was severely impaired in the absence of vTR while, the tumor formation in the chickens infected with vchTR was similar to those infected with the wild-type or revertant virus. Our results provided the first evidence that the overexpression of the cellular TRs can complement the functions of vTR in MDV-induced tumorigenesis. In the second part of this study, we wanted to address if EBERs (EBER-1 and EBER-2) possess tumor promoting functions and can transform chicken T cells using a small animal model for MDV-tumorigenesis. We generated recombinant MDVs expressing either EBER-1 or EBER-2 instead of vTR, termed vEBER-1 and vEBER-2. Expression levels of EBERs were detected during the viral lytic replication in vitro. EBERs were highly expressed and comparable to vTR expression in the wild-type or revertant. Furthermore, the recombinant mutants were replicating efficiently in cell culture and in infected animals. To assess the tumor promoting properties of EBERs, we performed an animal experiment where the infected animals were monitored for tumor development. EBERs partially restored the tumor formation if compared to the vTR-deletion. Tumor incidence with vEBER-2 was higher than with vEBER-1 compared to the wild-type. Our results for this aim displayed the potential tumorigenicity of EBERs their ability to transform different host immune cells. Furthermore, it provided a useful model to investigate the activities of EBERs in the cellular transformation and the underlying mechanism using a small animal model for virus-induced cancer formation.

Das Virus der Marek‘schen Krankheit (MDV) ist ein onkogenes Alphaherpesvirus welches zur Entstehung von tödlichen Lymphomen führt. MDV kodiert für eine virale Telomerase RNA (vTR), die in allen Stufen des MDV-Lebenszyklus stark exprimiert wird. vTR ist für die durch MDV induzierte Tumorentstehung essentiell, wobei der zugrundeliegende Mechanismus nicht komplett verstanden ist. Trotz der hohen Sequenzhomologie zwischen vTR und der Wirtszell- Telomerase RNA (chTR) von 88% ist nicht untersucht ob die Überexpression von chTR zur Zellentartung beiträgt. Interessanterweise haben TRs und Ebstein- Barr-Virus (EBV)-kodierte RNAs (EBER-1 und EBER-2) gemeinsame Wechselwirkungspartner, welche in Menschen und Hühnern hochkonserviert sind. EBERs sind die am stärksten auftretenden viralen Transkripte in EBV Tumorzellen. Die Rolle dieser EBERs in der Tumorentstehung ist jedoch strittig. Ziel des ersten Teils der Dissertation war die Untersuchung, ob eine Überexpression der zellulären TRs (chTRs) tumorbegünstigende Funktionen im Tiermodell für herpesvirusinduzierte Tumorentstehung haben. In einer vTR Deletionsmutante (vΔvTR) des hochvirulenten MDV Feldstammes RB-1B wurde durch Two-step Red-mediierte Mutagenese chTR in den vTR Locus eingesetzt (vchTR). Per qRT-PCR wurden die vTR und chTR (in vchTR) Expressionsniveaus der Virusmutanten bestimmt. chTR Expressionsniveaus in vchTR war mit vTR im Wildtyp-Virus vergleichbar. Weder die vTR-Deletion noch die chTR Insertion hatte Einfluss auf die Virusreplikation in vitro und in vivo. Die Tumorentstehung war in Abwesenheit von vTR erheblich reduziert wohingegen die Tumorinzidenz in den vchTR infizierten Hühnern vergleichbar mit der Wildtyp- und der Revertantengruppe war. Diese Daten liefern die ersten Hinweise darauf, dass die Überexpression von zellulären TRs die Funktionen von vTR in der MDV induzierten Tumorentstehung komplementieren kann. Im zweiten Teil der Dissertation haben wurde Rolle der EBERs (EBER-1 und EBER-2) adressiert. Dabei war das Ziel herauszufinden ob die EBERs tumorbegünstigende Funktionen besitzen und Hühner-T-Zellen im Tiermodell für MDV-Tumorgenese transformieren können. Hierzu wurden rekombinante MDV Mutanten generiert die entweder EBER-1 oder EBER-2 an Stelle von vTR exprimieren: vEBER-1 bzw. vEBER-2. Die Expressionsniveaus beider EBERs wurde in lytisch infizierten Zellen in vitro getestet. Beide EBERs wurden stark exprimiert und waren mit der vTR Expression vom Wildtyp und der Revertante vergleichbar. Zusätzlich wurde eine effiziente Virusreplikation in Zellkultur und im Tiermodell beobachtet. Um die tumorfördernden Eigenschaften der EBERs zu untersuchen wurde ein Tierversuch durchgeführt, wobei die Tiere auf Tumorentstehung kontrolliert wurden. Die EBERs konnten, im Vergleich zur vTR Deletionsmutante, die Tumorentstehung teilweise wiederherstellen. Die Tumorinzidenz von vEBER-2 war höher als die von vEBER-1 verglichen mit dem Wildtyp. Diese Ergebnisse zeigen erstens mögliche tumorfördernde Eigenschaften der EBERs – auch, dass diese unterschiedliche Wirts-Immunzellen transformieren können. Zweitens bieten sie ein nützliches Tiermodell für virusinduzierte Krebsentstehung um die EBER- Aktivitäten in Zelltransformationen und die hier zugrundeliegenden Mechanismen zu untersuchen.