Autocrine and paracrine effects of mechanically regulated matrix metalloproteases in human mesenchymal stem cells

Abstract

Mechanical conditions have an impact on the early phase of bone healing and in particular on angiogenesis. Mesenchymal stem cells (MSCs) play a key role, due to their ability to home to the defect site, to differentiate into functional bone cells and to secrete pro-angiogenic factors. However, it is yet unknown how MSCs respond to the loading conditions during defect healing, and which proteins transduce the mechanical stimulus into the control of MSC function. Matrix metalloproteases (MMPs) and the tissue inhibitors of metalloproteases (TIMPs) are mechanically regulated in mesenchymal cells and are able to affect cell functions in an autocrine and paracrine manner. This project investigated MMP/TIMP levels in MSCs in response to mechanical loading, as well as the consequences for MSC function. Furthermore, the pro-angiogenic capacity of mechano-regulated MMP-2 was determined and the underlying mechanism of MMP-2 regulation in MSCs examined. The involvement of MMPs in migration, proliferation and osteogenic differentiation was evidenced using broad spectrum MMP inhibitors. Expression analysis detected MMP-2, -3, -10, -11, -13, -14 and TIMP-2 in MSCs at the mRNA and protein levels. Mechanical stimulation of MSC/fibrin constructs in a bioreactor system simulating conditions of early bone healing (30% compression at a frequency of 1Hz) resulted in increased concentrations of MMP-2, -3, -13 and TIMP-2 proteins, as well as enhanced gelatinolytic activities of MMP-2 and MMP-13. However, mRNA expression levels of MMPs/TIMPs showed no changes in response to mechanical stimulation. Specific inhibition of mechano-regulated MMP-2, -3 and -13 proved MMP-13 to be involved in osteogenic differentiation. Furthermore, MMP-2 appeared to alter MSC migration, although statistical significance was not reached. Detailed investigation of MMP-2 demonstrated enhanced gelatinolytic activities in early haematomas under large versus small interfragmentary movements. The measurement of MMP-2 from MSCs at varying loading conditions confirmed loading at 1Hz and 30% compression to be MMP-2-inducing and demonstrated 0.1Hz and 10% compression to be non-inducing. Supplementation with the Golgi disturbing agent, brefeldin A, prevented the mechanical up- regulation of MMP-2. In addition to the enhancement of pro-MMP-2 levels, also the activities of active-MMP-2 and TIMP-2 were elevated, while MMP-14 activity showed a trend of up-regulation. Furin inhibition suppressed this mechano- regulation of MMP-14 and active-MMP-2. A pro-angiogenic effect, seen for conditioned medium (CM) from MSCs loaded at inducing conditions, was reduced by blocking pro-MMP-2 activation, as well as by inhibiting active-MMP-2. Furthermore, addition of recombinant active-MMP-2 to CM partially compensated for ineffective loading. The results of this thesis suggest that MSC function is controlled by MMP/TIMP activity, which in turn is regulated by mechanical stimulation of these cells under conditions of uneventful healing. In the case of MMP-2, mechanical loading seems not only to stimulate levels of the secreted pro-enzyme, but also its activation cascade. Both mechanisms appear to contribute to the paracrine augmentation of angiogenesis in response to loading. Thus, a failure to induce cascades of MMP regulation might contribute to the impaired clinical outcome in suboptimally stabilised bone defects.

Mechanische Bedingungen beeinflussen die frühe Phase der Knochenheilung und insbesondere die Angiogenese. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind aufgrund ihrer Fähigkeit, zum Defektort zu migrieren, in Knochenzellen zu differenzieren und pro-angiogene Faktoren zu sezernieren, essentiell für den Heilungsverlauf. Bis heute ist jedoch unklar, wie MSCs auf die relevanten Belastungsbedingungen reagieren und welche Proteine die Übertragung des mechanischen Stimulus in ein verändertes Zellverhalten vermitteln. Matrix- Metalloproteasen (MMPs) und ihre Inhibitoren, die TIMPs, werden durch mechanische Stimulation in mesenchymalen Zellen reguliert und beeinflussen Zellfunktionen autokrin sowie parakrin. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob mechanische Belastung von MSCs zu einer Regulation der MMP/TIMP Expressionen/Aktivitäten führt, und ob dies Auswirkungen auf die Funktion der MSCs hat. Weiterhin wurde mechanisch-reguliertes MMP-2 in Bezug auf seine Regulation in MSCs sowie seine pro-angiogenen Eigenschaften überprüft. Dass MMPs in die Migration, Proliferation und osteogene Differenzierung involviert sind, wurde anhand von MMP Breitspektruminhibitoren gezeigt. Expressionsanalysen von MMPs detektierten MMP-2, -3, -10,- 11, -13, -14 sowie TIMP-2 in MSCs auf mRNA und Protein-Niveau. Mechanische Stimulation von MSC /Fibrin-Konstrukten in einem Bioreaktor, welcher die Bedingungen der frühen Knochenheilung simuliert (30% Kompression bei 1Hz), führte zu einer Erhöhung der MMP-2, -3, -13 und TIMP-2 Proteinexpressionen sowie erhöhten gelatinolytischen Aktivitäten von MMP-2 und -13. Es wurde hingegen keine Veränderung in der Genexpression festgestellt. Durch die spezifische Inhibierung von mechanisch-reguliertem MMP-2, -3 und -13 konnte ein Einfluss von MMP-13 auf die osteogene Differenzierung gezeigt werden. Darüber hinaus scheint MMP-2 die Migration zu beeinflussen. Detaillierte Untersuchungen von MMP-2 zeigten erhöhte gelatinolytische Aktivitäten in frühen Hämatomen, die großen interfragmentären Bewegungen ausgesetzt waren. Expressions- und Aktivitätsanalysen der mechanischen Regulation von MMP-2 in MSCs unter unterschiedlichen Belastungsbedingungen zeigten, dass 30% Kompression bei 1Hz MMP-2-induzierend und 10% Kompression bei 0,1Hz nicht-induzierend wirken. Neben einer Erhöhung von pro-MMP-2, wurden auch erhöhte Aktivitäten von aktivem MMP-2 und TIMP-2 detektiert. Zudem waren MMP-14 Aktivitäten tendenziell erhöht. Die Inhibierung von Furin unterdrückte diese Stimulation von MMP-14 und aktivem MMP-2. Eine pro-angiogene Wirkung des konditionierten Mediums (KM) von MSCs, die MMP 2 induzierender Belastung ausgesetzt waren, konnte durch Blockierung der pro MMP 2 Aktivierung sowie Inhibierung von aktivem MMP-2 reduziert werden. Zugabe von aktivem MMP-2 zum KM kompensierte hingegen teilweise eine ineffektive Belastung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Funktion von MSCs durch MMP-/TIMP-Aktivitäten reguliert wird, welche wiederum durch mechanische Stimulation dieser Zellen unter Bedingungen normaler Heilung aktiviert werden. Im Falle von MMP-2 scheinen das Pro-Enzym sowie aktiviertes MMP-2 zu einer parakrinen Stimulation der Angiogenese durch mechanische Belastung beizutragen. Infolgedessen könnte eine Störung in der Induktion der MMP-Regulation zur Beeinträchtigung des Heilungserfolges in suboptimal-stabilisierten Knochendefekten beitragen.