20 – 40 kDa OPN isoforms mediate chemotherapy resistance of mouse WAP-SVT/t breast cancer cells and prevent cell death by activation of a phospholipase C regulated mechanism

Abstract

Aberrant cellular signalling influencing the complex regulatory network of cell death and survival is a common cause of therapy resistance and tumour progression in breast cancer. Two independent cell lines established from a breast tumour originated in a WAP-SVT/t transgenic animal differ in their resistance to apoptosis. ME-A cells are sensitive to apoptotic stimuli such as growth factor depletion and treatment with anti-tumour agents (e. g. doxorubicin). ME-C cells are very insensitive to apoptotic stimuli and they carry a p53 missense gene mutation frequently observed in breast cancer. In co-cultivation experiments ME-C cells protected the ME-A cells from stress induced apoptosis. Osteopontin (OPN), a secreted glycoprotein, is selectively overexpressed by the ME-C cells as demonstrated by microarray and Western blot analysis and this protein seems to be the main anti-apoptotic factor. ME-C cell medium concentrate (MC) containing OPN prevented ME-A cell death induced by stress stimuli. ME-C cells secrete various OPN isoforms that were not produced by the ME-A cells. There are strong indications that the 20 – 40 kDa OPN isoforms are responsible for the anti-apoptotic activity. ME-A cells engineered to overexpress OPN did not produce the 20 – 40 kDa OPN isoforms, which indicate that additional cell-specific post transcriptional modifications must occur to obtain the specific isoforms which mediate the anti-apoptotic activity. The anti-apoptotic signal involves the activation of phospholipase C (PLC) as the phospholipase inhibitor U73122 restored ME-A cell apoptosis in the presence of ME-C cell MC. When both ME-A and ME-C cells were analysed for OPN receptors by flow cytometry and immunofluoresence experiments, it was demonstrated that both cell lines presented at their surfaces the integrin β1 subunit and CD44 receptors, which might be involved in the anti-apoptotic OPN signal transduction pathway.

Abweichende zelluläre Signalprozesse innerhalb der fein abgestimmten komplexen Regulationsmechanismen für Zelltod und Zellüberleben sind maßgeblich beteiligt an der Therapie-Resistenz und der Tumorprogression von Brustkrebs. Zwei unterschiedliche Zelllinien, isoliert aus einem einzelnen Brusttumor einer WAP-SVT/t transgenen Maus, unterscheiden sich erheblich in ihrem Ansprechen auf apoptotische Stimuli. Während die MEA Zellen empfindlich sind gegenüber der Apoptose Induktion durch Entzug von Wachstumsfaktoren (Serumentzug) und der Behandlung mit Chemotherapeutika wie Doxorubicin, sind die ME-C Zellen unempfindlich gegenüber diese Apoptose Stimuli. Die ME-C Zellen enthalten eine in Krebszellen häufig auftretenden Mutation im p53 Gen. Co- Kultivierungs Experimente ergaben, dass das Sekret der ME-C Zellen die ME-A Zellen vor der Stress induzierten Apoptose schützt. Microarray und Western Blot Analysen zeigten, dass das Glycoprotein Osteopontin (OPN) in den ME-C Zellen überexprimiert und sezerniert wird. Dieses Protein scheint der Hauptfaktor, für die antiapoptotische Aktivität im Sekret der MEC Zellen zu sein. Apoptoseresistenz wird erreicht, wenn das Medium Konzentrat (MC) der ME-C Zellen den ME-A Zellen zugefügt wird. Die ME-C und die ME-A Zellen sezernieren unterschiedliche OPN Isoformen. Der Vergleich der Zellsekrete führte zu dem Ergebnis, dass die 20 – 40 kDa OPN Isoformen, die nur in den ME-C Zellen MC vorkommen, für die antiapoptotische Wirkung verantwortlich sind. ME-A Zellen, die nach Transfektion eines OPN-Plasmids OPN überexprimieren, aber die 20-40 kDa OPN Isoformen nicht sezernieren, sind weiterhin sensitiv gegenüber der Stressinduzierten Apoptose. Das deutet darauf hin, dass zusätzliche zellspezifische posttranskriptionale OPN Modifikationen stattfinden müssen, die zur Entstehung der Isoformen mit der antiapoptotischen Aktivität führen. Die durch OPN eingeleitete antiapoptotische Signalkaskade wird über die Phospholipase C (PLC) vermittelt, da die Inkubation der ME-A Zellen mit dem Phospholipase C Inhibitor U73122 die antiapoptotische Wirkung des ME-C Zellsekrets aufhebt. Die Analyse der ME-A und ME-C Zellen auf das Vorkommen von OPN Rezeptoren mittels Durchflußzytometrie und Immunofluoreszenz zeigte die Expression von Integrin β1 und CD44 auf der Zelloberfläche. Beide Proteine könnten an der antiapoptotischen Signaltransduktion von OPN beteiligt sein.