dc.contributor.author
Escadafal, Camille
dc.date.accessioned
2018-06-08T02:01:23Z
dc.date.available
2014-08-28T05:59:34.505Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13929
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-18127
dc.description.abstract
Vector-borne diseases represent over 17% of all infectious diseases in humans
causing one billion deaths each year. Public health efforts to strengthen
vector-borne disease detection, surveillance and control have been intensified
and laboratories play a key role in this process. Since diagnostic methods for
vector-borne infections are often not standardized, it is essential to
evaluate the quality of diagnostic methods currently in use in laboratories by
organizing external quality assurance (EQA) programs. The first chapter of
this dissertation presents the organization and analysis of five EQA studies
on the serological and/or molecular detection of hantavirus, yellow fever
virus, Rift Valley fever virus and Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. The
analysis of all study results enabled to identify important weak points in the
diagnostic procedures performed by the different participating laboratories
and propose recommendations for the future development of EQAs. The next
chapters of the dissertation focus on the study and the development of
diagnostic tools for yellow fever virus (YFV) infections. The second chapter
describes the development of an isothermal molecular method for YFV detection
using recombinase polymerase amplification (RPA). The YFV RPA assay proved to
be a specific and sensitive detection method during testing with a low
detection limit and rapid processing time by using a portable instrument.
Therefore the RPA method can provide an affordable alternative to current PCR-
based technologies allowing an early and accurate molecular diagnosis of YFV
infections in low-resource remote endemic areas. A second diagnostic approach
for YFV infections was investigated by producing antibodies for the specific
detection of the non-structural 1 (NS1) protein which is already used as an
early diagnostic marker for dengue infections. Production and characterization
of three polyclonal anti-NS1 sera from guinea pig was performed and allowed
specific detection of the YFV NS1 in immunofluorescence and Western blot
assays. Even though the development of an ELISA assay could not be brought to
success within the frame of this study, preliminary results confirm the NS1
protein as a promising diagnostic marker for early detection of YFV infections
and provide a basis for the further development of a quantitative assay for
YFV NS1 detection. The third and last chapter of this dissertation describes
the development of tools for the study of the pathogenesis of YFV infections
in live cell imaging microscopy. For that purpose, fluorescent labeling of
viral proteins of the 17D vaccine strain was performed by using the
tetracysteine (TC-) tag technology (FlAsH). The project had been initiated at
the Robert Koch Institute where four full-length YFV-17D plasmids with the TC-
tag in the envelope or the capsid (C) protein had been constructed. In this
work, the potential use of the four YFV-17D constructs as models for the study
of YFV pathogenesis was investigated. One construct with the TC-tag in the C
protein lead to the production of live infectious virus particles and showed
similar growth characteristics compared to the parental 17D-virus. However,
further experiments revealed that the TC-tagged virus was not able to produce
fluorescence after staining with the FlAsH-reagent. In summary, the various
results of this PhD work are a significant contribution to the development of
international EQA programs for diagnostic methods of vector-borne viral
infections and to the enlargement of the methodological spectrum for the
investigation and diagnostics of yellow fever virus.
de
dc.description.abstract
Vektorübertragene Krankheiten verursachen über 17% aller Infektionskrankheiten
im Menschen und dadurch eine Milliarde Todesfälle pro Jahr. Bestrebungen des
Gesundheitswesens zur Erkennung, Überwachung und Kontrolle vektorübetragener
Krankheiten sind kontinuierlich verstärkt worden und mikrobiologische Labore
spielen dabei eine Schlüsselrolle. Da diagnostische Methoden zur Detektion
vektorübertragener Krankheiten häufig nicht standardisiert sind, ist es von
groẞer Bedeutung die Qualität der derzeitig in den Laboren verwendeten
Methoden durch die Durchführung externer Qualitätskontrollen (EQA) zu
evaluieren. Das erste Kapitel dieser Dissertation beschreibt die Organisation
und Analyse von fünf EQA Studien zur serologischen und/oder
molekularbiologischen Detektion von Hantaviren, Gelbfieberviren, Rift Valley
Fieber- und Krim-Kongo Hämorrhagisches Fieberviren. Die Analyse aller
Untersuchungsergebnisse zeigt Schwachpunkte in den diagnostischen Prozessen
der teilnehmenden Labore auf und liefert Verbesserungsvorschläge für die
zukünftige Entwicklung von EQAs. Die weiteren Kapitel dieser Arbeit
konzentrieren sich auf die Untersuchung und Entwicklung diagnostischer
Methoden zum Nachweis von Gelbfieberviren (GFV). Das zweite Kapitel beschreibt
die Entwicklung einer molekularen, isothermalen Methode zur GFV Detektion
mittels recombinase polymerase amplification (RPA). Hierbei erwies sich der
GFV RPA Assay als spezifische und sensitive Nachweismethode mit einem
niedrigen Detektionslimit und kurzer Bearbeitungszeit, die in einem tragbaren
Gerät durchgeführt werden kann. Die RPA Methode bietet daher eine
erschwingliche Alternative zu gegenwärtigen PCR-basierten Technologien, die
eine frühe und genaue Diagnose von GFV Infektionen besonders in
unterversorgten und entlegenen Endemiegebieten ermöglicht. Ein zweiter
diagnostischer Ansatz zum Nachweis von GFV Infektionen wurde durch die
Produktion von Antikörpern zur spezifischen Detektion des NS1-Proteins
untersucht. Das NS1-Protein wird bereits als früher diagnostischer Marker bei
Infektionen mit dem Denguevirus verwendet. Insgesamt wurden drei polyklonale
anti-NS1 Seren in Meerschweinchen hergestellt und charakterisiert, die eine
spezifische Detektion des GFV NS1-Proteins im Immunfluoreszenztest und Western
Blot ermöglichen. Obwohl die Entwicklung eines ELISA-Tests im Rahmen dieser
Arbeit nicht erfolgreich abgeschlossen werden konnte, bestätigen die
vorläufigen Ergebnisse das diagnostische Potential des NS1-Proteins für eine
frühe Detektion von GFV-Infektionen und liefern eine Grundlage für die weitere
Entwicklung eines quantitativen Tests zum Nachweis des GFV NS1-Proteins. Das
dritte und letzte Kapitel dieser Dissertation beschreibt die Entwicklung eines
Tools zur Untersuchung der GFV-Pathogenese mittels live cell imaging-
Mikroskopie. Dazu wurden virale Proteine des GFV Impfstammes 17D unter
Anwendung der Tetracystein (TC)-Technologie fluoreszenzmarkiert. Das Projekt
wurde zuvor am Robert Koch-Institut initiiert, wo vier GFV-17D Volllängeklone
hergestellt wurden, die den TC-Marker im Hüll- oder Capsid (C)-Protein tragen.
In dieser Arbeit wurde die Möglichkeit untersucht, diese vier GFV-17D
Konstrukte als Modellviren zur Untersuchung der GFV-Pathogenese zu verwenden.
Ein Konstrukt mit dem TC-Tag im C-Protein führte zur Produktion infektiöser
viraler Partikel und wies vergleichbare Wachstumseigenschaften zu dem
ursprünglichen 17D Volllängeklon auf. Allerdings zeigten weiterführende
Experimente, dass das Virus mit dem TC-Tag keine spezifische Fluoreszenz nach
einer Färbung mit dem FlAsH Reagens aufwies. Zusammengefasst liefern die
verschiedenen Ergebnisse dieser Doktorarbeit einen bedeutenden Beitrag zur
Entwicklung internationaler EQA Programme für diagnostische Methoden zur
Erkennung vektorübertragener viraler Erkrankungen sowie zur Erweiterung des
methodologischen Spektrums für die Untersuchung und Diagnose von
Gelbfieberviren.
de
dc.format.extent
XI, 143 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Vector-borne viruses
dc.subject
external quality assessment
dc.subject
diagnostic methods
dc.subject
yellow fever virus
dc.subject
FlAsH fluoresecent tag
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Evaluation of diagnostic methods for vector-borne viral infections and
development of tools for the study of yellow fever infections
dc.contributor.contact
camille.escadafal@pasteur.fr
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Matthias Niedrig
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2014-07-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000097172-6
dc.title.translated
Evaluierung diagnostischer Methoden für vektorübertragene, virale Infektionen
und Entwicklung von Nachweismethoden zur Analyse von Gelbieberinfektionen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000097172
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000015718
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access