Nachweis von Mutationen im Gen des NfkappaB-Inhibitors alpha in kultivierten und primären Tumorzellen des Hodgkin Lymphoms

Abstract

Das Hodgkin Lymphom ist eine der häufigsten lymphoproliferativen Erkrankungen in den industrialisierten Ländern. Trotz grosser Erfolge in der Therapie sind die molekularen Zusammenhänge bisher weitgehend ungeklärt. Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, dass sich der Transkriptionsfaktor NfkappaB in den Tumorzellen des Hodgkin Lymphoms, den Hodgkin und Reed- Sternberg (HRS)- Zellen der physiologischen Steuerung entzieht und konstitutiv aktiv ist. Dies führt zu einer Deregulation zahlreicher Gene, die eine wichtige Rolle in der Apoptose, der Zellwachstumskontrolle und der Zelldifferenzierung und -aktivierung innehaben. Die transkriptionelle Aktivität im Zellkern wird unter anderem durch Bindung an Inhibitoren (IkappB) im Zytoplasma reguliert, wobei dem Inhibitor IkappaBalpha eine zentrale Rolle zukommt. Die Expression des IkappBα-Gens wird seinerseits durch NfkappaB in einem Regelkreis gesteuert. In der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, ob Defekte im IkappaBalpha- Gen für die konstitutive Aktivität von NfkappaB verantwortlich sind. In einem ersten Schritt wurde IkappaBalpha in Zelllinien, die von Hodgkin Lymphomen abstammen, auf Protein-, RNA-, und DNA-Ebene untersucht. In zwei von sieben Zelllinien fanden sich Mutationen, die zu einem trunkierten, nicht zur Inhibition des NfkappaB geeigneten Protein führten. Zur Klärung, ob diese Defekte auch bei primären HRS- Zellen im Gewebe zur konstitutiven Aktivität führen, wurden insgesamt 420 einzeln isolierte HRS- Zellen aus 10 Hodgkin- Fällen mittels einer zweistufigen single copy PCR auf Genmutationen untersucht. Dabei liess sich in einem Fall ein Stoppcodon nachweisen, dass ebenso zu einem trunkierten Protein führt. In einer in situ- Hybridisierung zum Expressionsnachweis von IkappaBalpha in 20 Hodgkin- Fällen fanden sich in der grossen Mehrzahl der Fälle eine starke Überexpression des Inhibitormoleküls. Dies zeigt erneut recht eindeutig den Zusammenhang zwischen einer Überexpression des NfkappaB-Proteins und der resultierenden Steigerung der Inhibitorexpression durch zellinterne Regelkreise. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Defekte im IkappaBα-Gen die konstitutive Aktivität von NfkappaB in HRS-Zellen nur zum Teil erklären können. Weitere, bisher nicht identifizierte Faktoren oder Mechanismen müssen in der Mehrzahl der Hodgkin Lymphom Fälle für die unkontrollierte Aktivität von NfkappaB und die daraus resultierenden Krankheitserscheinungen verantwortlich gemacht werden. Diese zu identifizieren wird die Aufgabe der kommenden Forschung sein.

The Hodgkin Lymphoma is one of the most common lympho-proliferative disorders in industrialized countries. Although significant therapeutical progress has been achieved in the past, the molecular mechanisms of the tumor development still remain unclear. Previous studies have shown that the transcription factor NfkappaB is constitutively active in Hodgkin and Reed-Sternberg (HRS)-cells, the actual tumor cells of the Hodgkin lymphoma. This leads to an unregulated activation of many target genes that are involved in the regulation of apoptosis, the control of cell-growth, differentiation and activation. The transcriptional activity of NfkappaB within the cell-nucleus is predominantly regulated by inhibitors (IkappaB) that bind NfkappaB in the cytoplasm. The inhibitor IkappaBalpha, whose expression is regulated in turn by NfkappaB through a negative feedback-mechanism, plays a central role in the inhibition of NfkappaB function. The main objective of this study was to investigate, whether genetic defects of IkappaBalphaare responsible for constitutive NfkappaB activity.

First, the IkappaBalpha gene, its mRNA and protein was analyzed in cell-lines derived from Hodgkin lymphomas. Two out of six cell-lines showed mutations that lead to truncated versions of the IkappaBalpha protein that are no longer capable of binding and inhibiting NfkappaB. Next, to examine whether similar mutations also occur in primary HRS-cells, the IkappaBalpha gene in 420 single HRS-cells of 10 Hodgkin cases was analyzed by a two-step single copy PCR. One case showed a premature stop-codon that also leads to a truncated version of the protein. Finally, the expression level of the IkappaBalpha mRNA was evaluated through in-situ hybridization experiments of 20 primary Hodkgin samples. In the vast majority of these cases a significant over-expression of IkappaBalpha was detected. This observation confirms the correlation between highly active NfkappaB and up-regulation of IkappaBalpha through intracellular regulatory mechanisms, but without causing a sufficient inhibition of NfkappaB in Hodgkin's´lymphoma.

These results show, that he constitutive activity of NfkappaB in HRS-cells can be partly explained by defects in the IkappaBalpha gene. However, in the majority of Hodgkin lymphomas other factors and mechanisms cause the unrestricted activity of NfkappaB. It remains a challenge for future research to identify these factors.