dc.contributor.author
Hillebrandt, Karl Herbert
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:47:02Z
dc.date.available
2018-02-28T11:53:58.650Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13874
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-18072
dc.description.abstract
Hintergrund: Der Organmangel ist nach wie vor der limitierende Faktor in der
klinischen Lebertransplantation. Das Konzept der De- und Rezellularisierung
von parenchymatösen Organen könnte langfristig die Generierung, autologer und
funktioneller Neo-Lebern ermöglichen. Dies soll durch die Rebesiedlung von
dezellularisierten porcinen Lebermatrizes mit hepatisch differenzierten,
induzierten, pluripotenten Stammzellen erreicht werden. Das Ziel unserer
Untersuchung war die Optimierung der Perfusionshomogenität, um dadurch die
Schäden der Dezellularisierung zu minimieren. Methoden: Es wurde ein bezüglich
der Prozessdauer (Gesamtzeit: 7 h) und Effektivität optimiertes
Dezellularisierungsprotokoll für Schweinelebern entwickelt. Dies konnte durch
die Anwendung einer Druck-kontrollierten Perfusion über die Leberarterie
(120mmHg) und die Pfortader (60mmHg) mit 1% Triton X-100 und 1%
Natriumlaurylsulfat erreicht werden. Es wurde der Einfluss oszillierender
Umgebungsdruckschwankungen auf den Dezellularisierungsprozess von
Schweinelebern (n=19) untersucht. Das eigens für die Erzeugung oszillierender
Umgebungsdruckschwankungen entwickelte Gerät imitiert die intraabdominellen
Bedingungen während der Respiration, um die Mikroperfusion der Leber zu
optimieren und dadurch die Homogenität der Dezellularisierung zu verbessern.
Wir analysierten die Effektivität der Perfusionsdezellularisierung mittels
makroskopischer Beobachtung, histologischer Färbungen (Hämatoxylin und Eosin
[H&E;], Sirius - Rot und Alcian Blau), immunohistologischer Färbungen
(Kollagen IV, Laminin und Fibronektin) und biochemischer Beurteilung (DNA-,
Kollagen- und Glycosaminoglykangehalt) der dezellularisierten Lebermatrizes.
Die Integrität der extrazellulären Matrix (EZM) nach der Dezellularisierung
wurde mit Hilfe von Ausguss-Präparaten, sowie der 3D Rekonstruktion einer
computertomographischen Untersuchung der Matrix analysiert. Ergebnisse: Es
konnte gezeigt werden, dass Lebern, welche mit oszillierenden
Umgebungsdruckschwankungen (P(+)) perfundiert wurden, homogener
dezellularisiert werden und weniger DNA-Gehalt aufweisen, verglichen mit
Lebern welche ohne oszillierende Druckschwankungen (P(-)) perfundiert wurden.
Mikroskopisch zeigten Lebern aus der P(-) Gruppe verbliebene Zellnester,
während in Lebern der P(+) Gruppe keine Zellen in der EZM mehr sichtbar waren.
Der Grad der EZM-Destruktion war höher in Lebern der P(-) Gruppe, obwohl sich
die Perfusionsraten und Perfusionsdrücke nicht signifikant zwischen den
Gruppen unterschieden. Die immunohistochemischen Färbungen zeigten, dass die
wichtigen EZM-Komponenten nach dem Dezellularisierungsprozess erhalten
bleiben. Die Ausgusspräparate zeigten ein intaktes Proteingerüst des
ehemaligen Gefäßsystems (Pfortader, Leberarterie und Lebervenen), sowie ein
erhaltenes Gallengangsproteinnetz. Zusammenfassung: Das hier vorgestellte
Protokoll zur Dezellularisierung von porcinen Lebern ist im Vergleich zu
bestehenden Protokollen schneller (7h) und effektiver. Die Anwendung
oszillierender Umgebungsdruckschwankungen verbessert die Perfusionshomogenität
und daraus resultierend das Ergebnis des Dezellularisierungsprozesses.
de
dc.description.abstract
Background: Organ scarcity is the major limiting factor in clinical liver
transplantation programs. Decellularization and recellularization of
parenchymal organs may facilitate the generation of autologous functional
liver like-organs by repopulation of decellularized porcine liver matrices
with induced liver cells. The aim of this study was to optimize the perfusion
homogeneity in order to minimize matrix damages caused by the
decellularization process. Methods: An accelerated (7 h overall perfusion
time) and effective protocol for human-scale liver decellularization by
pressure-controlled perfusion with 1% Triton X-100 and 1% sodium dodecyl
sulfate via the hepatic artery (120 mmHg) and portal vein (60 mmHg) was
developed. Furthermore, the effect of oscillating pressure conditions on pig
liver decellularization (n=19) was analyzed. The proprietary perfusion device
used to generate these pressure conditions mimics intra-abdominal conditions
during respiration to optimize microperfusion within livers and thus optimize
the homogeneity of the decellularization process. The efficiency of perfusion
decellularization was analyzed by macroscopic observation, histological
staining (hematoxylin and eosin [H&E;], Sirius red, and alcian blue),
immunohistochemical staining (collagen IV, laminin, and fibronectin), and
biochemical assessment (DNA, collagen, and glycosaminoglycans) of
decellularized liver matrices. The integrity of the extracellular matrix (ECM)
after decellularization was visualized by corrosion casting and three-
dimensional computed tomography scanning. Results: Livers perfused under
oscillating pressure conditions (P(+)) showed a more homogenous course of
decellularization and contained less DNA compared with livers perfused without
oscillating pressure conditions (P(-)). Microscopically, livers from the
(P(-)) group showed remnant cell clusters, while no cells were found in livers
from the (P(+)) group. The grade of disruption of the ECM was higher in livers
from the (P(-)) group, although the perfusion rates and pressure did not
significantly differ. Immunohistochemical staining revealed that important
matrix components were still present after decellularization. Corrosion
casting showed an intact vascular (portal vein and hepatic artery) and biliary
framework. Conclusion: In summary, the presented protocol for pig liver
decellularization is quick (7 h) and effective. The application of oscillating
pressure conditions improves the homogeneity of perfusion and thus the outcome
of the decellularization process.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
decellularization
dc.subject
tissue engineering
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Dezellularisierung porciner Lebern mittels oszillierenden Druckschwankungen –
Optimierung der Dezellularisierungshomogenität
dc.contributor.contact
karl-herbert.hillebrandt@charite.de
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2018-03-02
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000106102-5
dc.title.translated
Porcine liver decellularization under oscillating pressure conditions
en
dc.title.translatedsubtitle
technical refinement to improve the homogeneity of the decellularization
process.
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000106102
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