dc.contributor.author
Rosenthal, Lisa-Maria
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:46:21Z
dc.date.available
2016-06-15T10:50:53.786Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13857
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-18055
dc.description.abstract
Einleitung: Perinatale Asphyxie ist die dritthäufigste Todesursache in den
ersten vier Lebenswochen und kann zu schweren neurologischen Folgeschäden
führen. Die einzige evidenzbasierte Therapie ist die Absenkung der
Körpertemperatur auf 33-34 °C für 48-72 Stunden. Die Mechanismen der
Hypothermie-induzierten Neuroprotektion sind bis heute nur teilweise
verstanden. Insbesondere die Rolle der Kälteschockproteine RBM3 und CIRP
bleibt unklar. Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung eines Zellkulturmodells,
um den Einfluss von Hypoxie und Hypothermie auf das Zellüberleben, das
Proliferationsverhalten und den Zellmetabolismus sowie die Regulation von
Kälteschockproteinen zu untersuchen. Methoden: Für die Versuche wurden die
humane Zelllinie SK-N-SH und eine Zellkultur aus primären kortikalen Neuronen
verwendet. Hypoxie wurde mit Hilfe einer Hypoxiekammer mit
Sauerstoffkonzentrationen von 0,2 % bzw. 8 % für 24 Stunden durchgeführt.
Anschließend wurden die Zellen für 24, 48 oder 72 Stunden auf 33,5 °C gekühlt.
Zelltod wurde mit Hilfe der LDH- bzw. NSE-Aktivität in den Zellüberständen
quantifiziert. Für das Apoptoseverhalten wurde das Verhältnis von Procaspase 3
zu aktivierter Caspase 3 mittels Western Blot-Technik analysiert. Das
Proliferationsverhalten wurde mit der BrdU-Methode untersucht. Die
Zellmorphologie wurde durch Immunfluoreszenzfärbung von ßIII-Tubulin und DAPI
dargestellt. Der Zellmetabolismus wurde durch Messung des ATP-Gehalts und die
metabolische Aktivität mittels MTT-Reduktion untersucht. Die Regulation der
Kälteschockproteine RBM3 und CIRP wurde mit RT-PCR und Western Blot-Technik
analysiert. Ergebnisse: Schwere Hypoxie führte zu signifikant vermehrtem
Zellsterben in SK-N-SH, wohingegen milde Hypoxie keinen Einfluss auf das
Zellüberleben von SK-N-SH oder primären Neuronen hatte. Hypothermie reduzierte
signifikant den Zelltod durch Hypoxie. Weder schwere noch milde Hypoxie
führten zu einer erhöhten Apoptoserate und es war kein Einfluss auf die
Zellproliferation zu beobachten. Morphologisch führte schwere Hypoxie zu einem
Anschwellen der Zellsomata, Hypothermie reduzierte diese morphologischen
Veränderungen. Schwere Hypoxie reduzierte signifikant den ATP-Gehalt in SK-N
-SH-Zellen. Die metabolische Aktivität wurde weder durch milde noch durch
schwere Hypoxie sondern lediglich durch Hypothermie reduziert. Hypothermie
führte zu einer Induktion der mRNA von RBM3 in SK-N-SH und primären Neuronen,
sowie zu einer erhöhten RBM3-Proteinexpression in SK-N-SH. CIRP-mRNA und
–Protein wurden in SK-N-SH durch moderate Hypothermie ebenfalls hochreguliert,
die Unterschiede waren jedoch nur zu einigen Zeitpunkten signifikant. Weder
schwere noch milde Hypoxie hatten einen erkennbaren Einfluss auf die
Regulation von RBM3 und CIRP. Schlussfolgerungen: Moderate Hypothermie schützt
neuronale Zellen vor Zelluntergang durch Hypoxie. Darüber hinaus induziert
moderate Hypothermie die Kälteschockproteine RBM3 und CIRP sowohl auf
Transkriptions- als auch auf Translationsebene. Diese könnten mögliche
Mediatoren der Hypothermie-induzierten Neuroprotektion sein.
de
dc.description.abstract
Introduction: Perinatal asyphyxia is the third most frequent cause of death
occuring in the first 4 weeks of life and can also lead to severe neurological
damage. The only evidence-based therapy is to lower the body temperature to
33-34 °C for 48-72 hours immediately after birth. However, the mechanisms of
hypothermia-induced neuroprotection are still poorly understood, especially
the role of cold-shock proteins. Therefore, the aim of this study is to
establish a cell-based model to investigate the effects of hypoxia and
hypothermia on cell survival, proliferation, and cell metabolism, as well as
the regulation of cold-shock proteins. Methods: Experiments were performed
using a human SK-N-SH neuroblastoma cell line and mouse primary cortical
neurons. Cells were exposed to either 0,2 % or 8 % O2 for 24 hours in a
hypoxia incubator followed by cooling to 33,5 °C for 24, 48 or 72 hours. Cell
viability was assessed by LDH and NSE secretion into cell culture medium,
apoptosis was analyzed via caspase 3 activation by western blots and cell
proliferation was studied using BrdU cell proliferation assay kit. Neuronal
cell type and morphology was identified by immunofluorescence staining with
ßIII-Tubulin and DAPI. Cell metabolism was assessed by quantification of
intracellular ATP levels and MTT reduction. The regulation of the cold-shock-
proteins RBM3 and CIRP was analyzed via qRT-PCR and western blot. Results:
Exposure to severe hypoxia (0,2 % O2) significantly increased cell death in
the SK-N-SH cells, whereas mild hypoxia did not have an observable impact on
cell survival in either SK-N-SH or primary cortical neurons. Moderate
hypothermia for 48 or 72 hours rescued the cells from hypoxia-induced injury.
No effects on apoptosis or cell proliferation by either degree of hypoxia were
observed. However, severe hypoxia lead to observable cell swelling which was
attenuated by hypothermia. Exposure to severe hypoxia also resulted in
significantly reduced intracellular ATP-level in the SK-N-SH cells. Metabolic
activity was not influenced by mild nor severe hypoxia, but reduced by
hypothermia. RBM3 mRNA expression was induced by hypothermia in both SK-N-SH
and primary cortical neurons, but RBM3 protein expression was up-regulated in
response to hypothermia only in the SK-N-SH cells. Both CIRP mRNA and protein
were up-regulated under hypothermic conditions, but only significantly at some
time points. Neither mild nor severe hypoxia alone had an observable impact on
the expression of RBM3 and CIRP. Conclusion: Moderate hypothermia protects
neurons from hypoxia-induced cellular injury. Moreover, expressions of the
cold-shock proteins RBM3 and CIRP are induced by moderate hypothermia on both
the transcriptional and the translational levels. Cold-shock proteins could be
a possible mediator of hypothermia-induced neuroprotection.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
neuroprotection
dc.subject
cold-shock-proteins
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Regulation von Kälteschockproteinen nach moderater Hypothermie zur
Neuroprotektion nach Hypoxie
dc.contributor.contact
lisa-maria.rosenthal@charite.de
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2016-06-05
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000101750-7
dc.title.subtitle
ein Zellkulturmodell mit neuronalen Zellen
dc.title.translated
Regulation of cold-shock-proteins after moderate hypothermia for
neuroprotection after hypoxia
en
dc.title.translatedsubtitle
a cell culture model with neuronal cells
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000101750
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000018980
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access