Einleitung: Perinatale Asphyxie ist die dritthäufigste Todesursache in den ersten vier Lebenswochen und kann zu schweren neurologischen Folgeschäden führen. Die einzige evidenzbasierte Therapie ist die Absenkung der Körpertemperatur auf 33-34 °C für 48-72 Stunden. Die Mechanismen der Hypothermie-induzierten Neuroprotektion sind bis heute nur teilweise verstanden. Insbesondere die Rolle der Kälteschockproteine RBM3 und CIRP bleibt unklar. Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung eines Zellkulturmodells, um den Einfluss von Hypoxie und Hypothermie auf das Zellüberleben, das Proliferationsverhalten und den Zellmetabolismus sowie die Regulation von Kälteschockproteinen zu untersuchen. Methoden: Für die Versuche wurden die humane Zelllinie SK-N-SH und eine Zellkultur aus primären kortikalen Neuronen verwendet. Hypoxie wurde mit Hilfe einer Hypoxiekammer mit Sauerstoffkonzentrationen von 0,2 % bzw. 8 % für 24 Stunden durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen für 24, 48 oder 72 Stunden auf 33,5 °C gekühlt. Zelltod wurde mit Hilfe der LDH- bzw. NSE-Aktivität in den Zellüberständen quantifiziert. Für das Apoptoseverhalten wurde das Verhältnis von Procaspase 3 zu aktivierter Caspase 3 mittels Western Blot-Technik analysiert. Das Proliferationsverhalten wurde mit der BrdU-Methode untersucht. Die Zellmorphologie wurde durch Immunfluoreszenzfärbung von ßIII-Tubulin und DAPI dargestellt. Der Zellmetabolismus wurde durch Messung des ATP-Gehalts und die metabolische Aktivität mittels MTT-Reduktion untersucht. Die Regulation der Kälteschockproteine RBM3 und CIRP wurde mit RT-PCR und Western Blot-Technik analysiert. Ergebnisse: Schwere Hypoxie führte zu signifikant vermehrtem Zellsterben in SK-N-SH, wohingegen milde Hypoxie keinen Einfluss auf das Zellüberleben von SK-N-SH oder primären Neuronen hatte. Hypothermie reduzierte signifikant den Zelltod durch Hypoxie. Weder schwere noch milde Hypoxie führten zu einer erhöhten Apoptoserate und es war kein Einfluss auf die Zellproliferation zu beobachten. Morphologisch führte schwere Hypoxie zu einem Anschwellen der Zellsomata, Hypothermie reduzierte diese morphologischen Veränderungen. Schwere Hypoxie reduzierte signifikant den ATP-Gehalt in SK-N -SH-Zellen. Die metabolische Aktivität wurde weder durch milde noch durch schwere Hypoxie sondern lediglich durch Hypothermie reduziert. Hypothermie führte zu einer Induktion der mRNA von RBM3 in SK-N-SH und primären Neuronen, sowie zu einer erhöhten RBM3-Proteinexpression in SK-N-SH. CIRP-mRNA und –Protein wurden in SK-N-SH durch moderate Hypothermie ebenfalls hochreguliert, die Unterschiede waren jedoch nur zu einigen Zeitpunkten signifikant. Weder schwere noch milde Hypoxie hatten einen erkennbaren Einfluss auf die Regulation von RBM3 und CIRP. Schlussfolgerungen: Moderate Hypothermie schützt neuronale Zellen vor Zelluntergang durch Hypoxie. Darüber hinaus induziert moderate Hypothermie die Kälteschockproteine RBM3 und CIRP sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene. Diese könnten mögliche Mediatoren der Hypothermie-induzierten Neuroprotektion sein.
Introduction: Perinatal asyphyxia is the third most frequent cause of death occuring in the first 4 weeks of life and can also lead to severe neurological damage. The only evidence-based therapy is to lower the body temperature to 33-34 °C for 48-72 hours immediately after birth. However, the mechanisms of hypothermia-induced neuroprotection are still poorly understood, especially the role of cold-shock proteins. Therefore, the aim of this study is to establish a cell-based model to investigate the effects of hypoxia and hypothermia on cell survival, proliferation, and cell metabolism, as well as the regulation of cold-shock proteins. Methods: Experiments were performed using a human SK-N-SH neuroblastoma cell line and mouse primary cortical neurons. Cells were exposed to either 0,2 % or 8 % O2 for 24 hours in a hypoxia incubator followed by cooling to 33,5 °C for 24, 48 or 72 hours. Cell viability was assessed by LDH and NSE secretion into cell culture medium, apoptosis was analyzed via caspase 3 activation by western blots and cell proliferation was studied using BrdU cell proliferation assay kit. Neuronal cell type and morphology was identified by immunofluorescence staining with ßIII-Tubulin and DAPI. Cell metabolism was assessed by quantification of intracellular ATP levels and MTT reduction. The regulation of the cold-shock- proteins RBM3 and CIRP was analyzed via qRT-PCR and western blot. Results: Exposure to severe hypoxia (0,2 % O2) significantly increased cell death in the SK-N-SH cells, whereas mild hypoxia did not have an observable impact on cell survival in either SK-N-SH or primary cortical neurons. Moderate hypothermia for 48 or 72 hours rescued the cells from hypoxia-induced injury. No effects on apoptosis or cell proliferation by either degree of hypoxia were observed. However, severe hypoxia lead to observable cell swelling which was attenuated by hypothermia. Exposure to severe hypoxia also resulted in significantly reduced intracellular ATP-level in the SK-N-SH cells. Metabolic activity was not influenced by mild nor severe hypoxia, but reduced by hypothermia. RBM3 mRNA expression was induced by hypothermia in both SK-N-SH and primary cortical neurons, but RBM3 protein expression was up-regulated in response to hypothermia only in the SK-N-SH cells. Both CIRP mRNA and protein were up-regulated under hypothermic conditions, but only significantly at some time points. Neither mild nor severe hypoxia alone had an observable impact on the expression of RBM3 and CIRP. Conclusion: Moderate hypothermia protects neurons from hypoxia-induced cellular injury. Moreover, expressions of the cold-shock proteins RBM3 and CIRP are induced by moderate hypothermia on both the transcriptional and the translational levels. Cold-shock proteins could be a possible mediator of hypothermia-induced neuroprotection.
