Bisher existieren keine Arbeiten zur mRNA-Expression in zellfreier Bronchiallavage (BL). Die vorliegende Dissertation umfasst qualitative und quantitative Untersuchungen der mRNA-Expression in zellfreier BL, zellfreiem Serum und BL-Zellen. Die Untersuchungen ergaben folgende Ergebnisse: 1\. Extrazelluläre mRNA lässt sich in zellfreier BL detektieren. Es konnte mit verschiedenen Isolationsmethoden intakte, amplifizierbare mRNA aus zellfreier BL isoliert werden. 2\. Die Qualität und Quantität der mRNA aus BL, Serum und BL-Zellen sind ausreichend für weitere Untersuchungen. Neben ß-Aktin als Amplifikationskontrolle wurde mittels qualitativer PCR eine mRNA-Expression von HER2/neu, hnRNP-B1, MAGE-2, PGP 9.5, TTF-1, Telomerase (hTR und hTERT), Pericentrin und Aurora 2 in BL, Serum und BL-Zellen von Tumor- und Nichttumorpatienten detektiert. Die Expression einiger Gene wurde vermehrt in jeweils einem der untersuchten Materialien nachgewiesen. Beispielsweise wurde PGP 9.5 nur in der BL und BL-Zellen, aber nicht im Serum detektiert. Zusätzlich zu den erwarteten Produkten traten bei den Genen hnRNP-B1 und MAGE-2 Splicevarianten auf. Eine Unterscheidung der Tumor- von den Nichttumorpatienten war mit qualitativen Expressionsanalysen nicht möglich. 3\. Mit quantitativen Analysen von mRNA aus BL ist eine Unterscheidung zwischen Tumor- und Nichttumorpatienten möglich. Die absolute Quantifizierung der GAPDH-spezifischen mRNA mittels Real-Time PCR zeigte signifikant höhere GAPDH-Konzentrationen in der BL von Tumorpatienten als in der BL von Nichttumorpatienten. Die relative Quantifizierung der Gene hnRNP-B1 und MAGE-2 mit GAPDH als Referenzgen erbrachte signifikant höhere hnRNP-B1- bzw. MAGE-2-Kopienzahlen in zellfreier BL von Tumorpatienten im Vergleich zu Nichttumorpatienten. Die Ergebnisse der relativen Quantifizierung sind aufgrund der umstrittenen Eignung von GAPDH als Referenzgen und der geringen Patientenzahl kritisch zu betrachten. Die quantitativen Analysen der mRNA aus Serum und BL-Zellen zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen Tumor- und Nichttumorpatienten. 4\. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass zellfreie BL ebenso wie andere zellfreie Materialien, z. B. Serum, für mRNA- Expressionsanalysen geeignet ist.
Up to now, no works on mRNA expression in cell-free bronchial lavage (BL) exist. This thesis covers qualitative and quantitative analysis of mRNA expression in cell-free BL, cell-free serum and BL cells. The following results were obtained in this study: 1\. Extracellular mRNA can be detected in cell-free BL. Intact and amplifiable mRNA from cell-free BL could be isolated using different isolation methods. 2\. The quality and quantity of mRNA from BL, serum and BL cells are sufficient for further investigation. In addition to ß-actin as an amplification control, an mRNA-expression of HER2/neu, hnRNP-B1, MAGE-2, PGP 9.5, TTF-1, telomerase (hTR and hTERT), pericentrin, and Aurora 2 is detected in BL, serum, and BL cells of tumor and non-tumor patients using qualitative PCR. The expression of some genes was found in each one of the study materials. For example, PGP 9.5 was detected only in the BL and BL cells, but not in the serum. In addition to the expected products, splice variants occurred in genes of hnRNP-B1 and MAGE-2. A differentiation of tumor from non-tumor patients with qualitative expression analysis was not possible. 3\. It is not possible to distinguish between tumor and non-tumor patients with quantitative analysis of mRNA from BL. The absolute quantification of GAPDH specific mRNA by means of real-time PCR showed significantly higher GAPDH concentrations in the BL of tumor patients than in the BL of non-tumor patients. The relative quantification of the genes hnRNP-B1 and MAGE-2 with GAPDH as reference yielded significantly higher numbers of hnRNP-B1 and MAGE-2 in cell-free BL of tumor patients compared to BL of non-tumor patients. The results of the relative quantification may be considered critical because of the controversial suitability of GAPDH as reference gene and the small number of patients. The quantitative analysis of mRNA from serum and BL-cells doesn’t show significant differences between tumor and non-tumor patients. 4\. The examinations of this study show that cell-free BL just as other cell-free materials, e.g., serum, is suitable for mRNA-expression analysis.
