Einbau und Quantifizierung modifizierter Sialinsäuren in humane Glykoproteine

Abstract

Die Sialylierung von Glykoproteinen und Glykolipiden auf der Zelloberfläche von Eukaryoten spielt in Entwicklung und Regeneration sowie in der Pathogenese von Krankheiten eine wichtige Rolle. Die in vitro und die in vivo Modifikation von Sialinsäuregruppen in Glykoproteinen hat sich daher als potentes Werkzeug zur Untersuchung der Biologie dieser Zucker erwiesen. Ein biosynthetischer Ansatz zur Darstellung vorher nicht zugänglicher C-7-modifizierter Sialinsäuren auch in lebenden Zellen wird präsentiert. Dies wurde durch den metabolischen Einbau von synthetischem N-acetyl-4-azido-4-deoxymannosamin (4 -azido-ManNAc) in Glykane von Säugerzellen erreicht. Dabei blieb die bioorthogonale Reaktivität der Azido-Gruppe für anschließende Markierungsreaktionen bei ansonsten unveränderter Molekülstruktur erhalten. Die relative Einbaurate wurde durch selektive Abspaltung der Sialinsäuren aus Membranproteinen mit anschließender Markierung und Analyse via Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) bestimmt. Hohe Einbauraten konnten mit Zelllinien erhalten werden, die im Schlüsselenzym der Sialinsäurebiosynthese, der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase defizient waren. Insbesondere wurde eine starke Präferenz der selektiven C-7-Modifizierung von Sialinsäuren in O-glykosylierten Proteinen gefunden.

Sialylation of glycoproteins and glycolipids on eukaryotic cell surfaces plays an important role during development, regeneration and in the pathogenesis of diseases. The in vitro and in vivo modification of sialic acids in glycoproteins has therefore become a powerful tool to study the biology of these sugars. A biosynthetic approach to access previously inaccessible C-7 modified sialic acids even in living cells is presented. This was achieved by metabolic incorporation of synthetically derived N-acetyl-4-azido-4-deoxy- mannosamine (4-azido- ManNAc) into glycans of mammalian cells, thereby preserving the bioorthogonal functionality of its azido group for subsequent labelling with biophysical probes with an otherwise maintained molecule composition. The relative uptake was determined by the selective cleavage of sialic acids from membrane proteins followed by subsequent labelling and analysis by high performance liquid chromatography (HPLC). High incorporation rates could be achieved by the use of cell lines deficient in UDP- GlcNAc-2-epimerase/ManNAc kinase deficient, a key enzyme in sialic acid biosynthesis. Importantly, a strong preference for the selective C-7 modification in sialic acids of O-glycosylated proteins was found.