Microfluidics-basierte Quantifizierung zirkulierender Endothelzellen bei pulmonalarterieller Hypertonie

Abstract

Hintergrund: Die pulmonalarterielle Hypertonie (PAH) ist eine ätiologisch heterogene, proliferative kardiovaskuläre Erkrankung, die mit einer hohen Mortalität einhergeht. Zirkulierende Endothelzellen (circulating endothelial cells, CECs) werden als potentielle Biomarker zur Diagnose und Verlaufsbeurteilung bei PAH diskutiert. Die aktuell verfügbaren Methoden zur Isolierung und Quantifizierung dieser Zellen sind aber zeit- und arbeitsaufwendig. Fragestellung: Ziel dieser Studie war es, eine auf Microfluidics-Technologie basierende Plattform zur Messung von CECs zu entwickeln und diese bei PAH-Patienten zu validieren. Methoden: Basierend auf einer aus Vorarbeiten verfügbaren polymerischen diagnostischen Plattform zur Quantifizierung endothelialer Progenitorzellen (endothelial progenitor cells, EPCs) wurde ein modifizierter Microfluidics-basierter Chip für die CEC Messung entwickelt. Humanes Vollblut wurde gesammelt und in die Microfluidics- Plattform injiziert. Hier erfolgte die Bindung der Zellen an anti-CD146 Antikörper-tragende Mikrosäulen. Nach Komplettierung der immunfluoreszenzbasierten Färbungen wurden die Zellen ausgezählt. Ergebnisse: Zuerst wurde der CEC Chip gegen konventionelle Durchflusszytometrie validiert (r = 0.89, n=7). Danach wurden die CEC Zahlen von 66 weiblichen PAH-Patienten mit denen von Kontrollpatienten ohne PAH verglichen. Es konnte eine signifikante, drei- bis fünffache Erhöhung der CEC Zahlen bei PAH gezeigt werden (p < 0.001). Diese war unabhängig von der Subgruppenzugehörigkeit der PAH-Patienten (idiopathische/hereditäre PAH, Medikamenten-induzierte PAH und Connective Tissue Disease-assoziierte PAH). Eine Korrelation zu den potentiell den Krankheitsverlauf beeinflussenden Faktoren Alter und Body Mass Index bestand nicht. Diskussion: Der Microfluidics CEC Chip ist zur schnellen und verlässlichen Bestimmung der CEC Zahl geeignet. Der Chip benötigt 200-400 μl Vollblut und bietet potentiell die Grundlage für ein bettseitiges Screening von Patienten mit PAH oder anderen mit Gefäßschäden assoziierten Erkrankungen.

Background: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a proliferative cardiovascular disease of heterogeneous etiology. PAH is still associated with a high mortality. Thus, methods allowing for a timely diagnosis and adequate risk-stratification are highly warranted. Circulating endothelial cells (CECs) have been discussed as potential biomarkers in patients with PAH. However, current protocols for isolation and quantification of these cells are laborious and time-consuming. Objective: The aim of this study was to develop a disposable microfluidic chip platform capable of enumerating CECs and to test whether CECs measured by this device may serve as useful biomarker in patients with PAH. Methods: We previously developed a polymeric cell-affinity microfluidic diagnostic platform for the enumeration of human endothelial progenitor cells (EPC). Herein, we developed a modified chip for CEC detection. Human whole blood was collected and injected into microfluidic chips containing microcolumns pre-coated with anti-CD146 antibodies. Captured cells were immunofluorescently stained for additional stem and endothelial cell markers and enumerated by fluorescence microscopy. Results: The CEC capture chip was initially validated against conventional flow cytometry (r = 0.89, n=7). In a cohort of 66 patients with three types of PAH (idiopathic/heritable, drug-induced, and connective tissue disease), CEC numbers were significantly increased 3-5 fold in PAH subjects vs. matched controls (p < 0.001) and CEC numbers were comparable across PAH sub-classes. However, they were not related to the potential disease modifiers age and body mass index. Discussion: The CEC capture chip allows for a rapid and reliable detection of CECs. The device requires 200-400 μL of whole blood and can potentially be automated. Thus, it may serve as a bedside test for the screening and monitoring of patients with PAH and other diseases related to vascular injury.