Die Darstellung von Lipopeptiden und die Herstellung Lipopeptid-modifizierter Trägersysteme erfolgte analog zur Leitstruktur von P2A2. Die kovalente Kopplung von 2 Palmitoylketten (P2) am N-Terminus der Peptidsequenz bildet die Grundlage für die Generierung und Modifizierung nanopartikulärer Strukturen. Es konnte gezeigt werden, dass die Dipalmitoylierung auch bei oligo- Arginin(P2R12)-, oligo-Lysin(P2K12)- und oligo-Glutaminsäuresequenzen (P2E12) zur Aggregation zu Mizellen im mikromolaren Bereich führt, deren Stabilität sich jedoch unterscheidet. Zusätzlich ermöglicht die zweifache Palmitoylierung eine stabile Bindung der Lipopeptide in die Lipiddoppelschicht von Liposomen. Größenuntersuchungen ergaben für Lipopeptid-Mizellen einen Durchmesser von 10- 15 nm. Das Oberflächenpotential der Peptidmizellen war abhängig von der Peptidsequenz entweder positiv bzw. negativ. Die PEG-Ketten von Lipopeptid-PEG-PE-Mizellen maskieren die Ladung der Peptidsequenz, wodurch nur geringe Änderungen des Potentials von PEG-PE-Mizellen zu beobachten war. Lipopeptid-modifizierte Liposomen wurden in den Größenklassen 25 und 100 nm hergestellt. Je nach molarem Peptid-zu-Lipid-Verhältnis kommt es bei Liposomen zur Veränderung des Zetapotentials entsprechend der Ladungseigenschaften der Peptidsequenz. Zudem konnte gezeigt werden, dass P2R12, P2K12 und P2E12 die Integrität von Liposomen auch bei längerer Lagerung nicht stören. Die Bildung einer amphipathischen α-Helix, wie es nur bei P2A2 zu beobachten war, führt zur Störung der Lipiddoppelschicht. Aufnahmeuntersuchungen Lipopeptid-modifizierter Nanopartikel wurden an Kapillarendothelzellen des Gehirns (HBMEC) und an Aortenendothelzellen (HAoEC) durchgeführt. Die Lipopeptid-Mizellen und Liposomen zeigten keine zytotoxischen Eigenschaften bis zu einer Konzentration von 5 μM und auch die Inkubation über 4 Stunden mit P2R12 Liposomen hatten keine Einfluss auf die Viabilität von Hirnkapillarendothelzellen. Die Aufnahmeuntersuchungen zeigten unterschiedliche Aufnahmemuster in Abhängigkeit von der Peptidsequenz, Besetzungsdichte und Größe des Trägersystems. Lipopeptidmizellen zeigten die höchste Interaktion mit den Zellen. Eine verbesserte Aufnahme in HBMEC gegenüber HAoEC konnte für P2A2- und P2R12-Mizellen beobachtet werden. Auch P2R12-modifizierte Liposomen zeigten eine Selektivität gegenüber Hirnkapillarendothelzellen, die bei anderen Lipopeptidliposomen (P2A2, P2K12) nicht gefunden wurde. Die selektive P2R12-vermittelte Aufnahme ist somit unabhängig von der Peptidbesetzungsdichte und der Größe der Trägersysteme. Für das Lipopeptid P2A2 hingegen ist eine hohe Peptiddichte und eine geringe Trägergröße Voraussetzung für eine selektive Aufnahme in Hirnkapillarendothelzellen. P2A2-Mizellen und P2R12-Systeme werden Clathrin- vermittelt internalisiert. Dies spricht für eine Aufnahme nach Bindung an zellmembranständige Proteoglykane. Ein hohes Expressionslevel an Proteoglykanstrukturen, speziell Syndecan-2, wurde für Hirnendothelzellen gezeigt, was somit als primärer Bindungspartner anzusehen ist. Die Xe- basierte Hyper-CEST MRT ist eine nicht-invasive Methode mit ausreichend hoher Sensitivität, die sich als hilfreich bei der indirekten Quantifizierung der Zellselekti- vität P2R12-modifizierter Liposomen erwiesen hat. Die Inkorporation der für die Xe-MRT notwendigen Kryptophan-Struktur (CrA) in Liposomen erfolgte mittels Extrusion. So war es möglich, große Mengen des hydrophoben CrA in einem Trägersystem zu transportieren. Anschließend erfolgte die Modifizierung des Trägers mit dem Lipopeptid P2R12. Viabilitätsstudien zeigten zytotoxische Effekte von reinem CrA, welche bei CrA-beladenen P2R12 Liposomen nicht auftraten. Die Selektivität von CrA- beladenen P2R12-Liposomen für HBMEC konnte sowohl mittels Fluoreszenz- basierter Aufnahmestudien als auch mithilfe der Xe-basierten Hyper-CEST MRT bei einer Zellkonzentration von ca. 1*10^6 Zellen/ml gezeigt werden. Somit bieten Lipopeptid-modifizierte Liposomen neben der zielgerichteten Aufnahme in HBMEC die Möglichkeit, die Sensitivität der Hyper-CEST MRT um das 10-fache zu verbessern.Die gewonnenen Ergebnisse sollen die Grundlage für erste in vivo Hyper-CEST MRT Studien von Lipopeptid-modifizierten Trägersystemen bilden. Die zellphysiologischen Eigenschaften von Hirnkapillarendothelzellen, wie die Überexpression von LDL-Rezeptoren und eine bestimmte Zusammensetzung der Proteoglykanmatrix, ist auch bei Gliomazellen zu finden. Daher bietet sich die Lipopeptidmodifizierung von Trägersysteme an, um die Totoxizität von Zytostatika gegenüber Gliomazellen zu erhöhen. Aufnahmeuntersuchungen von Lipopeptid-modifizierten PEG-PE-Mizellen zeigten eine verbesserte Aufnahme in HBMEC gegenüber HAoEC, obwohl diese Mizellen ein leicht negatives Zetapotential besitzen. Ähnlich der Aufnahme von P2R12-Liposomen unterschiedlicher Peptidbesetzungsdichte ist die Zellselektivität von P2R12 -PEG-PE-Mizellen für HBMEC unabhängig von der Oberflächenladung des Trägersystems. Das Arginin-reiche P2R12 vermittelt die höchste Aufnahme von PEG-PE-Mizellen in Gliomazellen. Mit Paclitaxel (PCL) beladene Lipopeptid-PEG- Mizellen zeigen eine ca. 10 % höhere Zytotoxizität gegenüber Glioblastomazellen im Vergleich zu unmodifizierten PCL-PEG-PE-Mizellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung von Vektorpeptiden, wie dem P2R12, zur Adressierung von Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke, sowie von Gliomazellen geeignet ist. Die präsentierten Ergebnisse zeigen, dass Lipopeptide vielversprechende Vektoren für eine zielgerichtete Ansteuerung von Hirnkapillarendothelzellen und Gliomazellen sind. Speziell oligo-Arginin Peptide zeigen zellselektive Eigenschaften unabhängig von der Größe und der Peptidbesetzungsdichte der hier untersuchten Trägersysteme. Die Mo- difikation anderer Trägersysteme, wie z.B. Polymerpartikel oder Lipid- Nanopartikel, ist je nach Anwendungsgebiet denkbar und bietet die Möglichkeit, die vielversprechenden Eigenschaften der Lipopeptide weiter zu studieren und zu optimieren.
Lipopeptides and lipopeptide-modified carrier systems were generated according to the parent peptide P2A2. Covalent coupling of two palmitoyl chains (P2) at the N-terminus of the peptide sequence provides the basis for generating peptide based nanoparticulate structures. Like P2A2 synthesized poly-arginine (P2R12), poly-lysine (P2K12) and poly-glutamic acid (P2E12) peptides were found to self associate into micelles in a low micromolar concentrations. Furthermore, the palmitoylation provides stable anchoring in the lipid bilayer of liposomes and in PEG-PE micelles. The size of lipopeptide micelles was 10-15 nm and their surface potential correlates with the charge properties of the peptide sequence. PEG chains are known to mask charge properties of carrier systems and therefore all lipopeptide-modified PEG-PE micelles showed a slightly negative zeta potential comparable to peptide-free structures. Besides peptide micelles, small (25 nm) and large (100 nm) lipopeptide- modified liposomes were prepared. With different molar peptide-to-lipid ratios the zeta potential changes with respect to the charge characteristics of the peptide sequence. It was shown that P2R12, P2K12 und P2E12 did not alter the integrity of the POPC-layer of liposomes. The formation of an amphipathic α-Helix, as it was observed for P2A2, leads to perturbation of the lipid bilayer. Uptake studies of lipopeptide-modified nanoparticles were performed with brain capillary endothelial cells (HBMEC) and aortic endothelial cells (HAoEC). The lipopeptide-micelles and -liposomes showed no cytotoxicity up to a concentration of 5 μM. Furthermore, no cytotoxic effects of P2R12-liposomes were found after an incubation time of 4 h. The uptake studies showed different interaction patterns depending on the peptide sequence, peptide surface density and size of the carrier system. Peptide-micelles showed pronounced interaction with cells. Notwithstanding, that only P2A2 and P2R12 micelles showed an improved uptake into HBMEC compared to HAoEC, solely P2R12-modified liposomes showed selectivity for brain endothelial cells. Hence, the uptake-mediating effect of P2R12 is independent of the peptide surface density and the size of the carrier systems. However, for P2A2 a high peptide density and high flexibility of the peptide moiety are prerequisite properties for a pronounced uptake in HBMEC compared to HAoEC. P2A2 micelles and P2R12 systems were internalized via clathrin-mediated endocytosis. This results point to an uptake after binding to cell surface-standing proteoglycans. Additionally, proteglycans are suggested binding partners of the structurally related TAT peptide. Furthermore, a high expression level of proteoglycans, especially syndecan-2, was found in brain endothelial cells. Hence, proteoglycans are considered to be one of the major binding partners of arginine-rich lipopeptide systems. Xe-based Hyper-CEST MRI is a noninvasive method with high sensitivity for an indirect quantification of the cell selectivity of P2R12-modified liposomes. The biosensor Cryptophan (CrA), which is necessary for Xe Hyper-CEST MRI, was incorporated into liposomes via the simple extrusion method. This method allows to incorporate and transport large amounts of CrA. Afterwards, CrA-bearing liposomes were modified with P2R12. Viability studies showed cytotoxic effects of CrA alone, which were not observed with CrA-loaded P2R12-liposomes. The cell selectivity of P2R12-CrA- liposomes was confirmed by fluorescence-based and Xe-based Hyper-CEST MRI uptake studies. Xe Hyper-CEST MRI studies were perfor- med with a HBMEC concentration of about 1*10^6 cells/ml. Hence, in addition to the selective targeting properties of lipopeptide-modified liposomes, the sensitivity of Hyper-CEST MRI could be improved by at least one order of magnitude compared to other studies. The results obtained Hyper-CEST MRI studies with lipopeptide-modified carrier systems provide the basis for future in vivo studies. Cell physiological properties of brain capillary endothelial cells, such as the up regulation of LDL receptors and a specific composition of the proteoglycan matrix were also found in glioma cells. Therefore, the surface modification of existing carrier systems could lead to an improved cytotoxicity against glioma cells. Uptake studies of lipopeptide-PEG-PE micelles showed improved internalization in HBMEC compared to HAoEC, although these micelles have a slightly negative zeta potential. The cell selectivity of P2R12-micelles is independent of the peptide surface density, as it was found for P2R12-modified liposomes. The arginine-rich P2R12 showed the highest uptake-mediating efficiency for modified PEG-PE micelles in glioma cells. Paclitaxel (PCL)-loaded lipopeptide-PEG micelles revealed an 10% higher cytotoxicity in glioblastoma cells compared to unmodified PCL PEG-PE micelles. P2R12 PEG-PE micelles without paclitaxel had no cytotoxic effect. This studies demonstrate that vector peptide, such as the P2R12, are promising candidates targeting endothelial cells of the blood-brain barrier and glioma cells. In summary, lipopeptides were found to be promising vectors targeting brain capillary endothelial cells and glioma cells. Especially oligo-arginine peptides showed cell selectivity independent of the size of the carrier system or the peptide surface density. The modification of other carrier systems, such as polymer particles or solid lipid nanoparticles seems to be possible and will help to understand and optimize the promising properties of lipopeptides.
