RACK1 - ein neuer Interaktionspartner von p27KIP1 in normoxischen und hypoxischen Kardiomyozyten

Abstract

Die mangelnde Regenerationsfähigkeit des Herzens ist der Grund dafür, dass trotz Erfolgen in der Primärprävention und Akutbehandlung des Herzinfarktes die Lebensdauer und –qualität eines großen Teils betroffener Patienten stark eingeschränkt ist. Die Stimulation adulter Kardio-myozyten zur Teilung könnte zum Ersatz des entstandenen Gewebsdefektes mit voll funktions-fähigem Herzmuskelgewebe führen. In vielen Zellgeweben steuert p27KIP1 als cdk- Inhibitor unter anderem die Regulation des Zellzyklusstopps in der G1-Phase. Da cdk im adulten Herzen herunterreguliert sind, stellte sich die Frage, ob alternative Bindungspartner außerhalb der Gruppe der cdk in Kardiomyocyten detektierbar sind. Mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems kann in dieser Arbeit erstmals mit RACK1 ein neuer Interaktionspartner von p27KIP1 in Herzmuskelzellen präsentiert werden. RACK1 ist bekannt als Anker-und Shuttle- Protein für PKCß2. In den vorliegenden Versuchen mit vier Tage alten, neonatalen Rattenkardiomyozyten wurde erstmals gezeigt, dass p27KIP1, RACK1 und PKCß2 in vitro und in vivo in normoxischen Kardiomyocyten in einem trimolekula-ren Komplex vorliegen. Dabei verhindert RACK1 durch Bindung an p27KIP1 dessen Degradation durch PKCß2. Dadurch wird vermutlich zytoplasmatisches p27KIP1 heraufreguliert und die nucleäre Inhibition von cdk2 verhindert. An der Schwelle zur Differenzierung kann dies eine teilungsermöglichende Funktion in neonatalen Zellen von RACK1 aufzeigen. Dem entgegen steht, dass die Kinaseaktivität von PKCß2 durch Bindung von p27KIP1 gehemmt wird und dadurch die Differenzierung der Kardiomyozyten ermöglicht. Eine erneute vergleichende Untersuchung in neonatalen und adulten Zellen wäre für weiterführende Aussagen notwendig. In jedem Fall ist durch Nachweis der Koordinierung von p27KIP1 und PKCß2 durch RACK1 eine Verbindung zwischen der Zellzykluskontrolle und der Steuerung von Wachstums- und Differenzierungsprozessen nachgewiesen. Die hier gezeigten Daten lassen darauf schließen, dass unter hypoxischen Bedingungen RACK1 zytoplasmatisches p27KIP1 stabilisiert, indem es die Degradation durch PKCß2 verhindert. Somit wird der apoptoseauslösende Abfall von p27KIP1 verhindert. Dies könnte dazu führen, dass die Kardiomyozyten vor Zelluntergang bei einer Ischämie, ausgelöst z.Bsp. durch Infarkt, geschützt werden. Von zukünftigem Interesse ist dabei die Frage, ob und an welchem Zeitpunkt in der postischämischen Periode eine Auflösung der Komplexierung erfolgt. Vorstellbar ist, dass PKCß2 in der reaktiven Hypertrophie im Rahmen des Remodeling eine Rolle übernimmt. Es ist außerdem möglich, dass PKCß2 während einer Hypoxie eine bisher unbekannte Rolle zufällt. Dafür spricht die Translokation in andere Zellkompartimente nach Aktivierung im Vergleich zu normoxischen Kardiomyozyten [90]. Die Bedeutung dieser Arbeit liegt in der Entdeckung der bisher unbekannten Interaktion von p27KIP1, RACK1 und PKCß2 in normoxischen und hypoxischen neonatalen Kardiomyozyten. Inwieweit diese Interaktion eine Rolle in der Zellzyklusregulation durch p27KIP1 in seiner Funk-tion als CKI spielt, oder eine völlig neue eigenständige Funktion von p27KIP1 z.Bsp. in der Apoptoseinhibition unter hypoxischen Bedingungen in Kardiomyozyten darstellt, erfordert weitere Nachforschungen. Das Vorliegen dieses Komplexes in neonatalen Kardiomyozyten und während der Akutphase der reaktiven Prozesse nach einem Infarktgeschehen kann als Knotenpunkt verschiedenster Signal-wege verstanden werden. Die Interaktion zwischen RACK1, p27KIP1 und PKCß2 könnte eine Schaltstelle der Zelle abbilden, welche der Ausbalancierung der Zelle zwischen Wachstum und Hypertrophie auf der einen und dem Zelltod auf der anderen Seite dienen. Durch medikamentöse Stabilisierung dieses Komplexes könnte eine Eindämmung der Apoptose und eine positive Beeinflussung der Inotropie am Herzen nach Infarkt erreicht werden. Dazu bedarf es jedoch sicher noch weiterführender Untersuchungen.

Due to the lack of regenerative ability of the heart, the lifespan and -quality of affected patients is limited despite successes in primary prevention and acute treatment of myocardial infarction. Stimulation of adult cardiomyocytes into division could lead to a successful replacement of scar tissue with fully functioning heart muscle tissue. Cdk ihnhibitor p27KIP1 controls the regulation of cell cycle stops in the G1-phase in many tissue types. But cdks are downregulated in the adult heart the question whether alternative binding partners can be detected outside the group of cdk in cardiomyocytes. Using the Yeast Two Hybrid System can be identified RACK1 , a new interaction partner of p27KIP1 in heart muscle cells. RACK1 is known as anchor and shuttle protein for PKCß2. The presented experiments with four-day old neonatal rats show for the first time that p27KIP1, RACK1 and PKCß2 are present in vitro and in vivo in normoxic cardiomyocytes in a trimolekular complex. RACK1 prevents the degradation of p27KIP1 by PKCß2 probably via the upregulation of cytoplasmic p27KIP1. This results in the prevention of cdk2-inhibition in the nucleus. This might show a division facilitating function of RACK1 in neonatal cells on the threshold of differentiation. On the other hand the inhibition of kinase activity of PKCß2 by binding to p27KIP1, may enable the differentiation of cardiomyocytes. A comparative study in neonatal and adult cells would be necessary for further statements. In any case the coordination of p27KIP1 and PKCß2 by RACK1 showes a link between cell cycle control and the control of growth and differentiation processes. The data shown here suggest that under hypoxic conditions RACK1 is stabilizing cytoplasmic p27KIP1 by preventing the degradation of PKCß2. Thus the decrease of p27KIP1 is prevented and therefore apoptosis. Cardiomyocytes may be protected from cell death during ischemia, triggered for example by infarction. The question arises whether and at what point in the postischemic period this complexation ends. Most likely PKCß2 plays a role in the reactive hypertrophy during remodelling maybe also a previously unknown role during hypoxia. The significance of this work lays in the discovery of previously unknown interaction of p27KIP1, RACK1 and PKCß2 in normoxic and hypoxic neonatal cardiomyocytes. To what extent this interaction is involved in cell cycle regulation via p27KIP1 and its function as a CKI, or represents a completely new role of p27KIP1 for example inhibiting apoptosis under hypoxic conditions in cardiomyocytes requires further investigation. The existence of this complex in neonatal cardiomyocytes during the acute phase of reactive processes after infarction can be seen as an intersection of different signal pathways. The interaction between RACK1, p27KIP1 and PKCß 2 could represent a hub of cellcycle which mediates the balance of the cell between growth and hypertrophy on the one hand and death on the other side. By drug stabilization of this complex a reduction of apoptosis and a positive influence on the inotropy of the heart after infarction could be reached. This requires, however, certainly more investigations.