Radioimmunoassay and radiochemical procedure determination of cutaneous uptake and metabolism of sex steroid hormones

Abstract

Estrogen HRT has been widely used for treatment of the postmenopausal symptoms and osteoporosis as well as reducing the risk of coronary heart disease. Recently, also a stimulation of wound healing has been described. But, because of the negative outcome of the recent studies, and increased risk of breast and endometrial cancers, today, estrogen replacement therapy is recommended only for symptomatic women and for a period as short as possible. Extensive hepatic estradiol metabolism of oral estrogens may be the cause for this adverse effect on the cardiovascular outcome. To minimize these adverse effects of oral estrogen HRT, the transdermal route of administration may be an important consideration. Moreover, the use of testosterone (precursor for local estrogen formation) as adjuvant therapy to the estrogen HRT was recommended by recent studies to reduce the dose of estrogen. Therefore, we compared the perfused pig forelimb, split skin of porcine and human origin, human separated epidermis, and commercially reconstructed human epidermis, as well as an airway model for testing percutaneous absorption and metabolism of sex-steroid hormones, estradiol and testosterone, to identify the models of high reproducibility and predictability for the in vivo situations. Firstly very sensitive assay methods had to be established. For the estimation of the testosterone and hydrocortisone concentrations, a liquid scintillation counting method was used with a sufficient LOD. Liquid scintillation counting, however, was not valid for studying the metabolism of E2 because it is non specific for the metabolites. Therefore, for the determination of the E2 metabolism in the skin, a commercially available RIA had to be adapted. In the first experiments, the static and the dynamic experimental set up were compared for obtaining the best setup, but the difference between both set ups failed to reach statistical significance. Then the effect of BSA addition on the permeation of substances was investigated in both E2 and testosterone experiments. Testosterone permeation from 10/90 ethanol-miglyol exceeded that from 100% and 60% ethanol solutions. Since we used ethanol in the donor vehicle, we had to carry MTT-test to evaluate the viability of reconstructed epidermis. The results showed that 10/90 E/M is less toxic for the skin than 60% and 100% ethanol. Moreover, MTT-test results showed also that the acceptor medium PBS plus 5 % BSA is more toxic than PBS alone. Lactate and LDH levels were also determined and confirmed the results of the MTT test. Histological examinations of the reconstructed epidermis after the experiments, however, revealed that the donor vehicle has no major effect on the histology of reconstructed tissue, if PBS or PBS plus 5%BSA served as acceptor media. In order to evaluate this operating protocol, we compared testosterone permeation through the same reconstructed epidermis to hydrocortisone absorption as a more hydrophilic control. Also, two water-based formulations, O/W and W/O emulsion, were compared to the 10/90 ethanol/miglyol solution. Determination of estrogen uptake by the reconstructed epidermis showed the influence of application vehicle on E2 uptake and metabolism. With split pig skin also the influence of ethanol on E2 metabolism was less pronounced. E2 uptake after the application of an E2-TTS to perfusion model for 6 h was 42.85% of the incorporated dose. The E2 concentration as well as those of E2 conjugates increased considerably in the perfusion medium and in the tissue. While E2 already increased within the first hour in the medium, E2-conjugates were first elevated after 2 h. There was even a lag time of about 3 h until E1 and E1 conjugate concentrations raised.

Hormonersatztherapie wurden zur Osteoporoseprophylaxe und -therapie sowie zur Reduktion des Risikos koronarer Herzerkrankungen verabreicht. Erst kürzlich wurde eine verbesserte Wundheilung unter Hormongabe beschrieben. Die eher negativen Resultate der Studien bezüglich des Risikos Brustkrebs oder Endometriumkarzinome unter der Hormontherapie zu entwickeln, fordern jedoch den streng indikationsgebundenen und zeitlich kontrollierten Einsatz der Hormone. Der "first-pass" Metabolismus des oral verabreichten Estrogens wird wahrscheinlich Ursache für die beobachteten nachteiligen Effekte am Herz- Kreislaufsystem sein. Die transdermale Therapie stellt daher eine Alternative dar, diese beobachteten nachteiligen Effekte der Hormonersatztherapie zu minimieren. Darüber hinaus wurde die adjuvante Gabe von Testosteron als Precurser des lokal gebildeten Estrogens empfohlen, um so die Dosis des Estrogens reduzieren zu können. Ein aussagekräftiges in vitro Modell könnte der Entwicklung der transdermalen Hormonersatztherapie deutlichen Vorschub leisten. Aus diesem Grunde wurde in dieser Arbeit das Hautpenetrations- und Metabolisierungsverhalten von den Steroidhormonen Estradiol und Testosteron am isolierten perfundierten Schweinebein, an Spalthaut von Schwein und Mensch, an humaner isolierter Epidermis sowie an rekonstruierten Epidermismodellen und Lungen-epithelmodellen getestet und verglichen, um das in vitro Modell zu ermitteln, dass die in vivo Situation der transdermalen Hormongabe am besten reflektiert. Zuerst musste im Labor eine sensitive Hormonanalytik etabliert werden, um Estradiol und Metaboliten sowie Testosteron in den Perfusaten und Rezeptormedien sowie im Hautmaterial analysieren zu können. Für Testosteron wurde die direkte Detektion der radiomarkierten Substanzen gewählt. Die Methode des direkten Verfolgens des Weges radioaktiv markierter Substanz in der Haut war für die Estradiol-Metabolismusexperimente nicht geeignet. Es wurde deshalb ein kommerziell verfügbarer Estradiol-Radioimmunoassay an die Fragestellung der Hautpenetration-, permeation und metabolismus adaptiert. Es wurde das statische gegen das dynamische Franzzell-system verglichen, die jedoch in ihrer Aussage keine statistisch signifikanten Unterschiede erkennen ließen. Der Zusatz von BSA im Rezeptormedium führte tatsächlich zu einer Verdopplung der permeierten Testosteron-konzentration, während die permeierten Estrogenkonzentrationen nicht beeinflusst waren. Die Testosteronpenetration aus 10/90 Ethanol/Miglyol Mischungen hat die aus 100 % und 60 % reinen Ethanols als Donormedium bei weitem überschritten, bei deutlich abgeschwächter nachweisbarer Toxizität (MTT-Test). Zur Beruteilung der Toxizität der Donor- und Rezeptormedien wurden außer dem MTT-Test weitere Verfahren, wie z.B. die Messung der freigesetzten LDH-Aktivitäten in den Rezeptormedien sowie der Laktatkonzentrationen herangezogen. Histologische Beurteilungen nach den Experimenten, insbesondere der humanen Kunsthaut, zeigten die größere Bedeutung der Rezeptormedien gegenüber den Donormedien hinsichtlich der Hautintegrität, wenn PBS bzw. PBS + 5 % BSA als Rezeptormedium zum Einsatz kamen. Die Ergebnisse der oben aufgeführten Vorexperimente resultierten in einem experimentellen Permeationsprotokoll, dass anhand der Permeation einer weiteren, jedoch hydrophileren Substanz, Hydrocortison, evaluiert wurde. Verglichen wurden die Permeationsdaten von Testosteron und Hydrocortison, die als O/W und W/O Emulsionen sowie als 10/90 Ethanol/Miglyol-Lösungen auf die humanen Kunsthäute aufgetragen wurden. Die Bestimmung der Estrogenpenetration- und Permeation an humaner Kunsthaut zeigte deutlich den Einfluss des Applikationsvehikels, nicht nur auf die Permeationsraten, sondern auch auf den Estrogenmetabolismus. Der Einfluss von Ethanol auf den E2 Metabolismus, der bei der humanen Kunsthaut in einer Reduktion des Metabolismus endete, war bei Schweinehaut weniger deutlich ausgeprägt.