Investigation of protein adsorption on nanocarriers for intravenous drug targeting

Abstract

Diese „Drug Targetings“ Studie hatte zum Ziel, die Nebenwirkungen von Arzneimitteln in vivo zu reduzieren und deren Selektivität zu erhöhen. Der bestimmende Faktor bei der i. v. Injektion für das in vivo Verhalten und dem Organ Targeting der Arzneistofftransporter ist das adsorbierte Blutprotein auf deren Oberfläche. Das Blutproteinadsorptionsmuster der Arzneistofftransporter bestimmt ihre biologische Identität im Körper und wird bestimmt durch deren physikochemische Eigenschaften. 2-DE hat sich als eine wertvolle Methode für die Analyse der Partikelproteinadsorptionsmuster in vitro herausgestellt. In dieser Arbeit wurden mehrere Partikelarten untersucht. Ihre Proteinadsorptionsmuster wurden mit 2-DE untersucht. Weiterhin wurden die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Partikeln diskutiert. Zuerst wurden einige wichtige Methoden dieser Arbeit vorgestellt. Die zweidimensionale Polyacrylamid Gel Elektrophorese (2D-PAGE; 2-DE) in Kapitel 2 und Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS), Zetapotential (ZP), Laserdiffraktometrie (LD) und Hochdruckhomogenisation (HPH) in Kapitel 3. Dann wurden in Kapitel 4 die Proteinadsorptionsmuster von verschieden SLN kurz beschrieben und die Wechselwirkungen zwischen den Partikeln und Proteinen diskutiert. Im Allgemeinem adsorbierten drei Arten von Proteinen auf den SLN: Albumin, Apolipoproteine und Fibrinogen. Die Ergebnisse der Experimente zeigen, dass Fibrinogen und Apolipoproteine ähnliche Wechselwirkungen zur SLN- Oberfläche haben und diese sich von denen von Albumin unterscheiden. Die geringe Fibrinogenaffinität wurde deutlich, als man die Plasmakonzentration erhöht hat, und anschließend mehr und stärker affine Apolipoproteine als Fibrinogen gefunden hat. Im Gegensatz dazu wurden bei ansteigender PEO- Kettenlänge (Hydrophilie) auf der SLN-Oberfläche die absinkenden Apolipoproteinmengen durch Fibrinogen ersetzt. Verglichen mit Apolipoproteinen und Fibrinogen, war das Adsorptionsverhalten von Albumin unabhängig von der Hydrophobie/Hydrophilie der SLN. Bei verschiedenen Inkubationszeiten von SLN, welche mit Surfactants beschichtet wurden, wurde nur eine sich ändernde Menge an adsorbierten Proteinen beobachtet, aber keine Unterschiede in den Proteinadsorptionsmustern. Normalerweise werden sterische Effekte (z. B. Konformation der absorbierten Surfactants), hydrophobe Wechselwirkungen und elektrostatische Effekte als drei wichtige Faktoren der Partikelproteinadsorption betrachtet. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Wechselwirkungen zwischen Fibrinogen/Apolipoproteinen und SLN hauptsächlich hydrophober Natur waren. Im Gegensatz dazu dominieren bei Albumin die elektrostatischen Wechselwirkungen. Deswegen konnten die hydrophilen PEO-Ketten der Surfactants das Adsorbtionsverhalten von Fibrinogen und Apolipoproteinen durch sich verändernde sterische und hydrophobe Wechselwirkungen beeinflussen. In Kapitel 5 wurden die Proteinadsorptionmuster von i. v. injizierbaren, mit Ei-Lecithin stabilisierten Öl-in-Wasser- Emulsionen in vitro mit 2-DE analysiert. Die 2-DE Ergebnisse zeigen, dass Nanoemulsionsproben ähnlich SLN hauptsächlich Apolipoproteine adsorbieren. Die Mengen und prozentualen Anteile adsorbierter Proteine auf den Emulsionsproben ändern sich deutlich mit der Inkubationszeit: Verschiedene adsorbierte Proteine neigen dazu zu desorbieren, wodurch sich ihr Anteil reduziert. Die Veränderungen der Proteinadsorption mit sich ändernder Inkubationszeit unterscheiden sich bei Nanoemulsionen und SLN, z. B. wegen sterischer Effekte der hydrophilen PEO-Ketten auf den SLN-Oberflächen. Die Gesamtmenge der adsorbierten Proteine auf den Nanoemulsionen nimmt mit Erhöhung der Inkubationszeit ab. Die Kenntnis von zeitabhängigen Proteinadsorptionsmustern wird hilfreich für das Verständnis der Proteinadsorptionskinetik auf Arzneistoffträgern sein. Außerdem zeigen die Versuchsergebnisse, dass Zentrifugation offensichtlich die Adsorption von kleinen Proteinen (z.B. ApoC- II, ApoC-III und ApoA-II) und die Desorption von großen Proteinen (ApoA-I, ApoA-IV, ApoE, Albumin und insbesondere ApoJ), durch die Verlängerung des Adsorptionprozesses auf etwa 1-2 Stunden, induziert. Im Vergleich zur Zentrifugation, ist die schnellere Gelfiltrationsmethode (nur ca. 15 min) besser geeignet, um die Nanoemulsion vom überschüssigen Plasma abzutrennen. In Kapitel 6 wurden verschiedene Hämoglobinpartikel untersucht: Reine Hämoglobinpartikel, Hämoglobinpartikel modifiziert mit HSA auf der Oberfläche und Hämoglobin-Hyaluronsäure-Partikel. Diese wurden als Blutersatz entwickelt und mit einer neuartigen 3-Schritt-Technik (Co-Fällung, Vernetzung und Auflösung) hergestellt. Die 2-DE Ergebnisse zeigen, dass Hämoglobinpartikel mit HSA weniger Proteine als die anderen beiden adsorbieren, weil das hydrophile HSA mehr hydrophile Oberflächen auf den Partikeln erzeugt und so die Proteinadsorption im Blut gehemmt hat. Außerdem wurde der Lösungsmitteleinfluss analysiert, welcher sehr geringe Auswirkungen auf die Proteinadsorption der reinen Hämoglobinpartikel sowie der HSA modifizierten Hämoglobinpartikel hatte. Somit wird also das Proteinadsorptionsmuster durch die Partikel selbst und nicht durch das verwendete Lösungsmittel bestimmt. Partikel werden weniger vom MPS erkannt, was zu einer längeren Zirkulationszeit im Blutkreislauf führt, wenn sie weniger Proteine, ausgenommen Albumin, absorbieren. Daher könnten die HSA Hämoglobinpartikel eine längere Zirkulationszeit im Blut als die beiden anderen Partikeltypen haben, weil sie viel weniger Protein adsorbiert haben. Somit sind diese das vielversprechendste Blutersatzmittel. In zukünftigen Untersuchungen wird ihr in vivo Verhalten in Tieren analysiert werden. In Kapitel 7 wurden vier Formulierungen von Rutin-Nanokristallen (Plantacare UP 2000 (0,1%) Rutin- Nanopartikel, Plantacare 2000 UP (1,1%) Rutin-Nanopartikel, Tween 80 Rutin- Nanopartikel und Poloxamer 188 Rutin-Nanopartikel) hergestellt und ihre Proteinadsorptionmuster wurden mit der 2-DE analysiert. Die 2-DE-Ergebnisse zeigen, dass die vier Formulierungen der Rutin-Nanokristalle eine ähnliche Gesamtmenge von adsorbierten Proteinen haben. Dennoch unterscheidet sich die adsorbierte Menge von ApoE auf den unterschiedlichen Partikeln. Plantacare 2000 UP (0,1%) Rutin-Nanopartikeln und Plantacare 2000 UP (1,1%) Rutin- Nanopartikel adsorbierten ähnliche Mengen von ApoE durch ihre identische Zusammensetzung auf ihren Oberflächen. Die Tween 80-Rutin Nanopartikel haben den höchsten Anteil an ApoE, was die besondere Bedeutung von Tween 80 Beschichtung auf die ApoE Adsorption zeigt. Die Poloxamer 188 Rutin- Nanopartikel adsorbierten kein ApoE aufgrund von sterischen Effekten und der Hydrophilie der PEO-Ketten auf der Oberfläche der Nanopartikel. ApoE ist in der Lage, Arzneistoffe ins Gehirn zu bringen. Daher haben die Tween 80 Rutin- Nanopartikel das Potenzial für ein Gehirn-Targeting, aber ihr in vivo Verhalten muss in nächsten Schritten in Tieren nachgewiesen werden. Somit wird die Perspektive eröffnet mit Rutin-Nanokristallen Alzheimer zu behandeln. Letztendlich hat diese Arbeit die Proteinadsorptionmuster und die Proteinadsorptionskinetik auf verschiedenen Nanocarriern (SLN beschichtet mit verschiedenen Surfactants, Nanoemulsionen, unterschiedliche Hämoglobinpartikel und verschiedene Rutin-Nanokristalle) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Eigenschaften der Partikeloberflächen die Proteinadsorption stark beeinflussen können (aufgrund von sterischen Effekten, hydrophoben Effekten, elektrostatischen Effekten usw.). Schließlich können die Arzneistoffträger mit dem höchsten Potential auf Grundlage ihrer Proteinadsorptionsmuster ausgewählt werden. Aber ihr in vivo Verhalten muss im nächsten Schritt in Tieren verifiziert werden. Somit stellt diese Arbeit einen Leitfaden dar, um das gewünschte Arzneimittel herstellen zu können. Viele Herausforderungen bleiben dennoch bis heute im Bereich des „Drug Targetings“: z. B. das Verständnis, wie Plasmaproteine an Partikel in vivo adsorbieren oder die Partikel besser in das Zielgewebe zu transportieren. Eingehende Studien in diesem Bereich sind in der Zukunft erforderlich. Alle diese Studien zielen auf die Entwicklung und die Verbesserung der Arzneistoffträger, damit diese Arzneistoffe besser ins Zielgewebe transportieren, um somit in der Nanomedizin angewendet werden zu können.

The study of drug targeting is for the purpose of reducing side effects and achieving selective effectiveness of drugs in vivo. The determining factor for the in vivo fate and organ targeting of drug carriers is the adsorbed blood proteins on the their surfaces after i.v. injection, and their blood protein adsorption patterns as their biological identities in the body are affected by the physicochemical properties of drug carriers. 2-DE has been proved to be a useful tool for analyzing the protein adsorption pattern of particles in vitro. In this work, several particle systems are covered. Their protein adsorption patterns are achieved by the 2-DE method. The interaction between proteins and particles are discussed as well. Firstly, some important instruments for this work have been introduced including two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-DE; 2D-PAGE) in chapter 2, photon correlation spectroscopy (PCS), zeta potential (ZP), laser diffractometry (LD) and high pressure homogenization (HPH) in chapter 3. Then, the adsorbed protein patterns on different SLN are briefly reviewed and the interactions between them are discussed in chapter 4. In general, three kind of proteins are adsorbed on SLN, including albumin, apolipoproteins and fibrinogen. Under the experimental conditions, the results indicate that fibrinogen and apolipoproteins possess similar interactions with the SLN surface but albumin different. The lower affinity fibrinogen was obviously displaced by the higher affinity apolipoproteins when the concentration of plasma increased, while by increasing of PEO-chain units (hydrophilicity) on the SLN surface, the decreased amounts of apolipoproteins could be complemented by fibrinogen. Compared with apolipoproteins and fibrinogen, the adsorption behaviors of albumin were independent from the hydrophobicity/hydrophilicity of SLN. The incubation time is just observed altering the adsorbed amount of proteins but not protein adsorption pattern on SLN coated with surfactant. Normally, the steric effects e.g., the conformation of absorbed surfactants, the hydrophobic interactions, and the electrostatic effects are regarded as three important factors of protein adsorption on the particle surface. Experimental results showed that the interactions between fibrinogen/apolipoproteins and SLN mainly is the hydrophobic effects. But albumin is very different from those two proteins, the electrostatic effects probably play a more important role on the interactions between albumin and SLN. Therefore, the hydrophilic PEO-chains of surfactants could affect the adsorption behaviors of fibrinogens and apolipoproteins by changing the steric effects and hydrophobic effects. In chapter 5, the protein adsorption patterns on the i.v. injection of egg lecithin-stabilized oil-in-water emulsions have been analyzed in vitro by 2-DE. The 2-DE results show that nanoemulsion samples mainly adsorb apolipoproteins as same as SLN. The amounts and percentages of adsorbed proteins on emulsion samples clearly change with incubation time: adsorbed proteins trend to desorb and different adsorbed proteins start to decrease their amounts and percentages at different incubation time. The changes of protein adsorption with incubation time on nanoemulsion are different from them on SLN because of e.g., steric effects of the hydrophilic PEO-chains on the SLN surfaces. The total amount of adsorbed proteins on the nanoemulsions decreases with increasing the incubation time. The knowledge of time-dependent protein adsorption pattern will be helpful for understanding the protein adsorption kinetics on the drug carrier system. Besides, the experimental results indicate that centrifugation has obviously induced the adsorption of small size proteins (e.g., ApoC-II, ApoC-III and ApoA-II) and the desorption of large size protein (ApoA-I, ApoA-IV, ApoE, albumin, especially ApoJ) due to extending the adsorption processes of proteins about 1-2 hours. Compared to centrifugation, the faster gel filtration method (merely about 15 min) is more suitable for separating the nanoemulsion system from extra plasma due to the shorter separation time. In chapter 6, Hemoglobin particles including pure hemoglobin particle, hemoglobin particles modified with HSA on the surface, and hemoglobin-hyaluronan-mixture particles were prepared as blood substitutes with a novel 3-step-technique (co-precipitation, cross-linking and dissolution). The 2-DE results show that hemoglobin particles modified with HSA adsorb much less proteins than the other two kind of particles including pure hemoglobin particles and hemoglobin-hyaluronan-mixture particles, because that human serum albumin, a hydrophilic protein, could create more hydrophilic surface on the particles to restrain the protein adsorption onto them in the blood. Besides, the medium is observed to have very slight impact on the protein adsorption of the pure hemoglobin particle as well as the hemoglobin particles modified with HSA, so the protein adsorption pattern on the particles is determined by the particles not by the medium. The particles are less recognized by the MPS to achieve longer circulation time in the bloodstream, if they absorb less proteins excluding albumin. Therefore, hemoglobin particles modified with HSA on the surface may have a longer circulation time in the blood than the other two kind of hemoglobin particles because of the much less adsorbed protein amounts, and will be the most promising ones for blood substitutes. Their in vivo behaviors will be assessed in the next step in animals. In chapter 7, four formulations of rutin nanocrystals (Plantacare 2000 UP (0.1 %)-rutin nanoparticles, Plantacare 2000 UP (1.1 %)-rutin nanoparticles, Tween 80-rutin nanoparticles, and Poloxamer 188-rutin nanoparticles) were prepared and their protein adsorption patterns were analyzed with the 2-DE method. The 2-DE results shows that the four formulations of rutin nanocrystals have similar total amount of adsorbed proteins. Nevertheless, the adsorbed amount of ApoE is altered on different particles. Plantacare 2000 UP (0.1 %)-rutin nanoparticles and Plantacare 2000 UP (1.1 %)-rutin nanoparticles have similar adsorbed amounts of ApoE due to their identical composition on their surfaces. Tween 80-Rutin nanoparticles have the highest amount of ApoE since Tween 80 coating on nanoparticles has specifical adsorption for ApoE. Finally, Poloxamer 188-rutin nanoparticles does not absorb ApoE because of the steric effects and hydrophilicity of the PEO chains on the nanoparticle surface. ApoE is able to deliver drugs to the brain. Therefore, Tween 80-rutin nanoparticle has the potential for brain targeting, but their in vivo behaviors have to be verified in the next step in animals. It opens the perspective of using rutin nanocrystals in Alzheimer treatment. All in all, this work has investigated the protein adsorption patterns on different nanocarriers including SLN coated with different surfactant, nanoemulsion, different hemoglobin particles and different rutin nanocrystals and discussed protein adsorption kinetics on them. The results shows that the properties of particle surfaces could dramatically affect protein adsorption on them due to the steric effects, hydrophobic effects, electrostatic effects and so on. Finally, the most potential of particles for drug carrier are chosen based on their protein adsorption pattern. But their in vivo behaviors have to be verified in the next step in animals. Nevertheless, this work has a guide to prepare the desired drugs. Many challenges still stay in this drug targeting area today, such as to understand how plasma proteins adsorb on particles in vivo, better way to control particles to the target tissue. In-depth study is required in this area in the future. All the studies aim at developing and improving drug carriers to better deliver drugs to target tissue and apply in nanomedicine.