New properties of murine Angiotensin I-converting Enzyme (mACE) and its catalytic domains

Abstract

Angiotensin-converting enzyme (ACE; EC 3.4.15.1, a metallopeptidase of the M-2 family) is known as most typical dipeptidyl-carboxypeptidase. Via this mechanism, ACE degrades important peptides like angiotensin-I (Ang I) and bradykinin (BK), and plays consequently a crucial role in several circulatory processes. Besides these well described processes, ACE evinces some unusual, not fully clarified functions. Among these are (i) unexpected endopeptidolytic activities of ACE on a few substrates (ii), receptor-like mechanisms (outside- in actions) of cell-bound ACE, and (iii) the molecular mechanisms of the sperm-bound ACE in the processes of fertilization and sperm-egg-contact, Using self-produced domain-selective forms of murine ACE (mACE), the experiments and data presented here should be regarded as contributing to the elucidation of such processes: (a) Studying the slow degradation of amyloid-beta peptides (Aβ), it has been demonstrated that unexpectedly both catalytic domains of mACE have similar hydrolytic activity on the N-terminal part of Aβ. Moreover, the results confirm that mACE has unequivocal endopeptidolytic activities. (b) Moreover, it is described here that ACE has GPI-targeted properties. This process is completely independent of its known peptidase activities. Such activity has been controversially discussed with respect to the essential function of ACE in the process of fertilization. The results presented here indicate that a spatial proximity between membrane-bound mACE and the endogenous, GPI-anchored CPM enables an ACE evoked release of CPM. (c) Finally, using mACE-transfected CHO-cells, the intracellular signaling after interaction with typical ACE-substrates or with inhibitors in living cells was analyzed. The data suggest that the two catalytic domains of mACE do not function independently, which means that the signal transduction in the mACE is influenced by negative cooperatives of the two catalytic domains. After all, these effects characterize ACE as an enzyme with multiple facets, far from being a simple dipeptidyl-carboxypeptidase. Bearing in mind that ACE is one of the most commonly used targets in modern medicine, further exploration of ACE should be more in the focus of research and will surely yield exiting news.

Das Angiotensin-converting Enzyme (ACE) (EC 3.4.15.1, eine Metallopeptidase der M-2 Familie) ist eine typische Dipeptidyl-carboxypeptidase. Über eine derartige hydrolytische Spaltung baut ACE physiologisch wichtige Peptide wie Angiotensin-I (AI) und Bradykinin (BK) ab, und spielt folglich eine entscheidende Rolle der Herz-Kreislauf Regulation. Neben diesen gut beschriebenen Prozessen besitzt ACE einige ungewöhnliche Funktionen deren Mechanismus noch weitgehend ungeklärt ist; dazu gehören (i) die völlig unerwarteten endopeptidolytischen Aktivitäten des ACE bei einigen Substraten, z.B. beim Abbau von Amyloid-beta (Aβ) Peptiden; (ii) die Wirkungen des Spermien-ständigen ACE beim Spermien-Eizell-Kontakt, die völlig unabhängig von der Peptidasewirkung des ACE sind, und (iii) die rezeptorartigen Mechanismen von membranständigem ACE bei intakten Zellen nach Reaktion mit Substraten und Inhibitoren des Enzyms. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, unter Nutzung von stabil-transfiziertem murinem ACE (mACE) in Modellzellen (CHO und MDCK) zur Klärung dieser Prozesse beizutragen. Außerdem wurde eine besondere Aufmerksamkeit auf die beiden Domänen-selektiven Formen den ACE gerichtet. (a) Es wurde der langsame Abbau von Aβ-Peptiden durch mACE und seine Domänen untersucht. Überraschenderweise zeigte sich, dass beide katalytischen Domänen einen nahezu gleichartigen Abbau der Aβ-Peptide bewirken. Die in der Literatur beschriebene endopeptidolytische Wirkung von hACE auf Aβ-Peptide ließ sich auch beim mACE und bei seinen beiden katalytischen Domänen nachweisen; dabei wurden neue Spaltstellen innerhalb des Aβ-Moleküls aufgefunden. (b) Es wurde nachgewiesen dass mACE mit Carboxypeptidase M (CPM), einem GPI-verankerten Membranprotein, interagiert. Dies gilt sowohl für lösliches als auch für membranständiges ACE und ist völlig unabhängig von der katalytischen Aktivität der Domänen des ACE. Derartige Wirkungen des ACE beim Prozess des Spermien- Eizell-Kontakts auf der Zona Pellucida wurden in der Literatur zuletzt sehr kontrovers diskutiert. Diese Ergebnisse belegen, dass bei Modellzellen die räumliche Nähe von ACE und dem GPI-verankerten CPM zu einer Interaktion und letztlich auch zu einem Release des CPM führen kann. (c) Schließlich wurde unter Nutzung von mACE-transfizierten CHO-Zellen und nach Reaktion mit typischen ACE-Substraten oder mit ACE-Inhibitoren ein intrazelluläres Signalling (via JNK und cJun) nachgewiesen. Die Daten zeigen, dass die beiden katalytischen Domänen in diesem Prozess nicht unabhängig von einander agieren, sondern sich im Sinne einer negativen Kooperativität beeinflussen. Die Interaktion mit Inhibitoren und Substraten führt letztlich zu signifikanten Änderungen der Expression von COX-2 und ACE. Die vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass das ACE offensichtlich Funktionen besitzt, die weit über den Rahmen einer typischen Dipeptidyl-carboxypeptidase-Wirkung hinausgehen. Berücksichtigt man, dass das ACE eines der wichtigsten Targets in der modernen Medizin ist, sollte die Erforschung dieser untypischen Wirkungen größte Aufmerksamkeit erlangen.