Zur Bewertung des Risikos im Fall einer absichtlichen Ausbringung von Brucellen in die Lebensmittelkette sind Kenntnisse zur Tenazität des Erregers in relevanten Lebensmittelmatrizes erforderlich. Daher wurde das Überleben von Brucella abortus 1119-3 in Rohmilch sowie in kommerziell erhältlichen Lebensmitteln wie H-Milch, Vorzugsmilch, Joghurt und stillem Mineralwasser bei handelsüblichen Lagerungstemperaturen untersucht. Besonders lange überlebten B. abortus 1119-3 und B. melitensis 16M in H-Milch, in der die Zellzahl anstieg und bis zum Ende des Versuchs nach 88 Tagen eine Konzentration von über 10^8 KbE/ml aufwies. In stillem Mineralwasser war B. abortus 1119-3 über einen Zeitraum von 60 Tagen kulturell nachweisbar, wobei die Zellzahl kontinuierlich abnahm. Bis zum Ende der Mindesthaltbarkeit des Produktes (jeweils vier Tage) überlebte der genannte Stamm in Vorzugsmilch und Rohmilch. In Joghurt konnten hingegen lebende Zellen nur zwei (1,5 % Fett), vier (3,5 % Fett) bzw. einen Tag (10 % Fett) nachgewiesen werden, wobei der schnelle Rückgang der Zellkonzentration wahrscheinlich durch den niedrigen pH-Wert von 4,2 verursacht wurde. Bei einer absichtlichen Kontamination würden Brucellen für zwei Wochen (stilles Mineralwasser) bzw. über Monate (H Milch) in einer hohen Konzentration in den Lebensmitteln überleben und beim Verzehr mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer Brucellose führen. Für die Erkennung und Typisierung von Brucellen im Fall der absichtlichen Kontamination von Lebensmitteln müssen geeignete Schnellmethoden zur Verfügung stehen. Deshalb wurden sechs verschiedene Methoden in Kombination mit der PCR auf ihre Effizienz zur Extraktion und zum Nachweis von Brucella-DNA aus relevanten Lebensmittelmatrizes untersucht. Für stilles Mineralwasser und physiologische Kochsalzlösung erwies sich das QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) mit einer Nachweisgrenze von 5 x 10^1 KbE/ml am sensitivsten. Für Rohmilch eigneten sich sowohl der Kit von Qiagen als auch die Phenol-Chloroform-Extraktion, wobei letztere mit höherer Zuverlässigkeit bis zu 5 x 10^1 KbE/ml nachwies. Die Nachweisgrenze für Brucellen in Joghurt (10 % Fett) lag bei Anwendung der Phenol-Chloroform-Extraktion mit 1 x 10^2 KbE/ml niedriger als mit dem QIAamp DNA Mini Kit (1 x 10^4 KbE/ml). Mit der für Milchprodukte tauglichen Phenol- Chloroform-Extraktion wurden bis zu 5 x 10^2 KbE/g in Camembert und in Ziegenfrischkäse nachgewiesen. Die DNA-Extraktion aus Weichkäse erfordert eine Homogenisation nach Verdünnung mit Flüssigkeit und führt deshalb zu einer Abnahme der Sensitivität. Im Gegensatz zur mehrere Tage dauernden Kultivierung von Brucellen auf Nährmedien, für die ein Labor der Sicherheitsstufe 3 erforderlich ist, kann durch die Kombination aus DNA-Extraktion und Real-Time PCR ein Nachweis innerhalb eines halben (QIAamp DNA Mini Kit) bzw. innerhalb eines Arbeitstages (Phenol-Chloroform-Extraktion) in einem Labor der Sicherheitsstufe 2 erfolgen. Eine Erhöhung der Sensitivität zum Nachweis der Brucella-DNA war allerdings mittels Real-Time PCR im Vergleich zur herkömmlichen PCR nicht möglich. Mit dem Ziel, die Nachweisgrenzen für Brucella-DNA insbesondere in Milchprodukten zu optimieren, wurde die immunomagnetische Separation (IMS) als spezielle Methode für die Voranreicherung und Aufreinigung der DNA untersucht. Zu diesem Zweck wurden tosylaktivierte immunomagnetische Partikel eingesetzt, die mit einem Brucellose-Vollserum bzw. einem monoklonalen anti-Brucella-Antikörper beschichtet waren. Trotz Optimierung der IMS in Abhängigkeit verschiedener Parameter, wie Probenvolumen, Inkubationszeit und temperatur lag die Grenze zum Nachweis der Brucella-DNA bei 5 x 10^3 KbE/g für Ziegenfrischkäse, bei 1 x 10^3 KbE/ml für Rohmilch und stilles Mineralwasser, bei 8 x 10^4 KbE/ml für Joghurt und bei 5 x 10^4 KbE/g für Camembert und war deshalb weniger sensitiv als die vorgenannten Extraktionsmethoden.
In case of a deliberate contamination of the food chain with brucellae it is important to know the survival of the bacteria in relevant food matrices. Therefore, the survival of Brucella abortus 1119-3 was investigated in raw milk as well as in commercially available foods like UHT-milk, certified raw milk, yogurt and still mineral water at general storage conditions. B. abortus 1119-3 and B. melitensis 16M survived longest in UHT-milk in which the total cell count multiplied to more than 10^8 cfu/ml at the end of the product’s shelf life after 88 days. In still mineral water viable cells of B. abortus 1119-3 could be detected for 60 days in culture. Until this day the total cell count declined continuously. In raw milk and certified raw milk this strain survived until the end of the product’s shelf life (four days, respectively). In yogurt viable cells could be detected for two days (1.5 % fat), four days (3.5 % fat) or one day (10.0 % fat), most probably due to the low pH of 4.2. In case of a deliberate contamination brucellae would survive at a high concentration for two weeks (still mineral water) or for months (UHT-milk) so that ingestion of the food would most probably lead to brucellosis. Suitable methods for the fast detection and typing of brucellae should be available in case of deliberate contamination of foods. Therefore, six different methods used in combination with PCR were examined regarding their efficiency to extract and detect Brucella-DNA from relevant food matrices. For extraction from still mineral water and physiological saline, the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) revealed the best detection limit of 5 x 10^1 cfu/ml. For raw milk both the kit and the phenol chloroform extraction were best suited of which the latter was more reliable at a detection limit of 5 x 10^1 cfu/ml. The detection limit for brucellae in yogurt (10 % fat) was better with phenol chloroform extraction (1 x 10^2 cfu/ml) than with QIAamp DNA Mini Kit (1 x 10^4 cfu/ml). By means of phenol chloroform extraction which is most suitable for milk products, the detection limit for Brucella DNA in camembert and goat cheese corresponded with 5 x 10^2 cfu/g. The extraction of DNA from soft cheese requires a homogenisation after dilution in a fluid which diminishes sensitivity. In contrast to cultivation of brucellae on nutrient agar for several days under biosafety level 3 conditions, the detection by using DNA extraction followed by real-time PCR can be achieved within half a working day (QIAamp DNA Mini Kit) or alternatively within one day (phenol chloroform extraction ) under biosafety level 2 conditions. However, the limit for detection of Brucella DNA could not be improved by use of real-time PCR compared to the classical PCR. In order to optimize the detection limits for Brucella DNA especially in milk products, the immunomagnetic separation (IMS) was tested as a pre-enrichment and purification procedure. For this purpose, tosyl activated immunomagnetic particles coated with brucellosis serum or with a monoclonal anti-Brucella antibody were used. Despite the optimization of IMS considering different parameters such as sample volume, incubation time and temperature, the limit for the detection of Brucella DNA was 5 x 10^3 cfu/g for goat cheese, 1 x 10^3 cfu/ml for raw milk and still mineral water, 8 x 10^4 cfu/ml for yogurt and 5 x 10^4 cfu/g for camembert and was thus less sensitive than DNA extraction methods mentioned above.
