Functional and phylogenetic analyses of chromosome 21 promoters and hominid- specific transcription factor binding sites

Abstract

Der Fokus dieser Arbeit liegt in der funktionellen Charakterisierung von Menschen- und Primatenpromotoren, einschließlich der genomweiten Lokalisierung und Validierung von humanspezifischen Transkriptionsfaktor-Bindestellen (TFBS) des essentiellen Transkriptions-faktors GABPa. In diesem Kontext war die Etablierung eines verbesserten PCR Protokolls, einschließlich der Entwicklung eines PCR enhancers, zur Amplifikation langer und GC-reicher Promotoren ein zentraler Bestandteil. Darauf aufbauend befasst sich ein Teil dieser Arbeit mit der Analyse eines Großteils der Promotoren des humanen Chromosoms 21 in Hinblick auf ihr Potential, Transkription in HEK293-Zellen anzutreiben, und regulatorische Regionen zu charakterisieren. Die beobachtete hohe Korrelation von Reportergenaktivität und endogener Expression, wie auch die Korrelation mit DNS-Sequenzelementen von wichtiger Funktion während der Transkriptionsinitiation, zeigen, daß transiente Reportergenassays dazu geeignet sind, endogene Generegulation an individuellen Promotoren wiederzuspiegeln. Diese Aussage wird unterstützt sowohl durch Versuche mit verkürzten Promotoren wie auch durch externe Stimulation der Reporterkonstrukte, mit dem Ergebnis, daß vor allem distale Promoterregionen in der Lage sind, endogen ablaufende Signalkaskaden in Reporteraktivität zu integrieren. In dieser Hinsicht wurde die Technik in einem Ansatz komparativer Genomanalyse angewandt, um human-spezifische TFBS funktionell zu testen. Zur Identifikation human- und hominiden-spezifischer TFBS wurde ein neuer Ansatz implementiert, der führende Programme und Algorithmen aus den Bereichen der Sequenzanalyse und komparativen Genomanalyse vereint. Diese Implementation wurde auf ChIP-seq-Daten von endogenen Bindestellen des humanen Transkriptionsfaktors GABPa angewandt. Unter den Genen mit human-spezifischen Bindestellen finden sich einige funktionell verwandte Gruppen von Genen, die ohne Schwierigkeiten mit human-spezifischen Eigenschaften in Verbindung gebracht werden können. Die funktionelle Analyse von Kandidatenbindestellen zeigte in konsistenter Weise den unterschiedlichen Einfluß von orthologen Promotoren aus Mensch, Schimpanse und Rhesusaffe auf die Reporteraktivitäten. Mutationsanalysen mit ausgewählten Bindestellen bekräftigten diese Ergebnisse. Insbesondere repräsentiert der TMBIM6-Promoter (transmembrane BAX inhibitor motif containing 6), der neben mehreren uncharakterisierten human-spezifischen Mutationen eine hominiden-spezifische GABPa-Bindestelle enthält, einen interessanten Kandidaten für Folgestudien, denn TMBIM6 ist beteiligt an der Reduktion von oxidativem Stress und ebenso an Diabetes, Arthereosklerose und verschiedenen altersbedingten neuro-degenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer und Parkinson. Diese Arbeit stellt die erste erfolgreiche Implementation eines genomweiten Ansatzes zur Identifizierung von jüngst evolvierten cis- regulatorischen Elementen dar, die einen messbaren Einfluß in einer humanen Zelllinie haben, auch im Vergleich zu unseren nächsten Verwandten, den Schimpansen.

The focus of this work addresses functional studies of human and primate promoters, and the genome-wide localization and validation of human-specific transcription factor binding sites of the essential transcription factor GABPa. In this context, the development of an improved PCR protocol, including the careful adjustment of PCR additives to compose an efficient enhancer mix, was central to the amplification of large GC-rich promoter fragments used as source for the functional studies. Based on this, part of the work assessed the potential of promoter-reporter constructs to drive transcription in human HEK cells, in order to capture regulatory regions corresponding to a large fraction of the human chromosome 21 genes. The results obtained in this study demonstrated the usefulness of transient transfection assays. The high correlations of reporter activities with endogenous expression levels of the corresponding genes, and with the presence of DNA sequence elements important for transcription initiation, indicate that transient reporter gene assays are capable of depicting endogenous transcription regulation for individual promoters in living cells. This finding was further underlined by the results obtained after either truncation and/or external stimulation of promoters, showing that especially distal promoter regions of reporter constructs are capable of integrating endogenous response signaling pathways into reporter activity. Thus, we applied this technology in a comparative genomics approach specially designed for identifying and testing human-specific transcription factor binding sites (TFBSs). To find TFBSs specific to human and hominids, a new approach was implemented combining leading tools in sequence analysis and comparative genomics. The established pipeline was applied to analyze ChIP-seq data capturing endogenous binding sites of the human transcription factor GABPa in HEK293 cells. Among the genes with human-specific binding sites, several functionally related groups were found, which can be linked without difficulties to human-specific traits. Functional testing showed consistent impacts of orthologous promoters of human, chimpanzee and rhesus macaque on the transcriptional outputs. Mutational analyses of candidate sites strongly supported these findings. In particular, the TMBIM6 (transmembrane BAX inhibitor motif containing 6) promoter, harboring several uncharacterized human-specific mutations and a hominid-specific GABPa binding site, represents an interesting candidate for follow-up studies, as TMBIM6 is involved in oxidative stress reduction and has been implicated in diabetes, atherosclerosis and in many of the aging-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s and Parkinson’s. This work presents the first successful implementation of a genome-wide approach to the identification of newly evolved cis-regulatory elements showing a specific function in human cells lines in comparison to our closest living relatives, the chimpanzees.