Intrazelluläre Qualitätskontrolle des Vasopressin-V2-Rezeptors

Abstract

Der nephrogene Diabetes insipidus (NDI) ist eine genetisch bedingte Erkrankung, die insbesondere durch Mutationen im Vasopressin-V2-Rezeptor (V2R) hervorgerufen wird. Mittlerweile sind mehr als 180 krankheitsauslösende Mutationen des V2R bekannt. In ca. zwei Dritteln der Fälle bleibt der mutierte Rezeptor intrazellulär retiniert und gelangt nicht an die Plasmamembran. Ursächlich hierfür ist die Qualitätskontrolle von Proteinen im Verlauf des intrazellulären Transportwegs. Bisher wurde angenommen, dass diese Qualitätskontrolle hauptsächlich im endoplasmatischen Reticulum (ER) stattfindet. In dieser Arbeit wurde anhand verschiedener Mutanten des Vasopressin-V2-Rezeptors gezeigt, dass auch das ERGIC (ER-Golgi-intermediate compartment) und der Golgi-Apparat eine entscheidende Rolle bei der Qualitätskontrolle spielen. In einem Zellkulturmodell mit transfizierten HEK 293 Zellen konnten V2R-Mutanten charakterisiert werden, die in unterschiedlichen intrazellulären Kompartimenten retiniert werden (im ER z.B. L62P, im ERGIC z.B. Y205C und im Golgi-Apparat z.B. G201D). Dafür wurden Glykosylierungs- und Oberflächenbiotinylierungsanalysen sowie Lokalisationsstudien mit Hilfe der Laser Scanning Mikroskopie durchgeführt. Die verschiedenen intrazellulären Lokalisationen der Rezeptormutanten konnten anschließend durch elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigt werden. Eine mögliche Ursache für diese Differenzierung im Qualitätskontrollsystem könnten Strukturunterschiede der mutierten Rezeptoren sein. So zeigten ER-Mutanten im Vergleich zu ERGIC-Mutanten ein differentes Abbaumuster nach Trypsin- Proteolyse. Zusammenfassend konnte am Beispiel des V2R gezeigt werden, dass die Qualitätskontrolle von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Säugerzellen nicht nur im ER sondern auch im ERGIC und im Golgi-Apparat stattfindet. Eine mögliche mechanistische Erklärung könnte in der unterschiedlichen Tertiärstruktur der mutierten Rezeptoren liegen

Mutations in the vasopressin-V2-receptor (V2R) gene can cause nephrogenic diabetes insipidus. More than 180 disease causing mutations of the V2R are known so far. In two thirds of the cases the mutant receptor will not reach the plasma membrane but be retained intracellularly due to the quality control system within the secretory pathway. Up to now it was thought that quality control predominantly takes place in the endoplasmic reticulum (ER). Using different V2R mutants it could be demonstrated that not only the ER but the ERGIC (ER-Golgi-intermediate compartment) and the Golgi apparatus play a pivotal role within the quality control system. V2R mutants were characterised using a cell culture model of transiently or stably transfected HEK293 cells and were shown to be retained in different intracellular compartments (in the ER, e.g. L62P; in the ERGIC, e.g. Y205C; and in the Golgi apparatus, e.g. G201D). Glycosylation state analysis and cell surface biotinylation assays were performed as well as analysing the intracellular localisation by laser scanning microscopy and immunogold electron microscopy. Structural differences of the receptor mutants might be one of the reasons for the different handling by the qualitiy control system. This was supported by limited proteolysis with trypsin as mutants being retained in the ER showed a different degradation pattern than the ERGIC mutants. In summary using the V2R as an example it could be demonstrated that quality control of G protein-coupled receptors not only takes place in the ER but in the ERGIC and Golgi apparatus as well and one of the reasons for that might be the different tertiary structure of each receptor mutant.