dc.contributor.author
Korge, Sandra
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:31:59Z
dc.date.available
2016-12-14T12:44:19.654Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13485
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17683
dc.description.abstract
In almost all vertebrate species, the adaptation to daily environmental
changes is enabled by intrinsic clock mechanisms, which are constituted of
cell-autonomous transcriptional-translational feedback loops (TTFLs). In
mammals, those molecular clocks are composed of the heterodimeric
transcriptional activators CLOCK and BMAL1, which bind to enhancer-elements in
the promoter region of their target genes such as cryptochrome (cry1 2) and
period (per1-3). CRY and PER undergo post-translational modifications in the
cytoplasm prior to inhibition of CLOCK/BMAL1 in the nucleus. To repress
transcription, PER and CRY proteins need to translocate back into the nucleus.
Although, it is known that phosphorylation and ubiquitination control the fate
of CRYs and PERs, triggering either their degradation or nuclear
translocation, our understanding of the actual nuclear entry process through
nuclear pores is limited. Proteins lager than 40 kDa such as PERs and CRYs
depend on active nucleocytoplasmic translocation. The predominant, “classical”
nuclear import is executed by Importin α and β, which recognize so called
classical nuclear localization signals (cNLS). Site-directed mutagenesis of
circadian clock-derived cNLSs as well as RNAi-mediated perturbation of the
classical nuclear import carriers decrease nuclear accumulation of circadian
clock proteins. In addition, the reduction of importin β transcript levels
lengthens the circadian period. Yet, up to now studies focused only on the
classical nuclear import of circadian clock proteins, whereas more than 60
different proteins comprise the nucleo-cytoplasmic translocation machinery,
suggesting a much more complex regulatory system. Until now, no systematic
approach was executed to investigate the impact of the nucleo-cytoplasmic
translocation machinery on circadian rhythm dynamics. Therefore, we first
examined the influence of nuclear import and export on the circadian clock
upon application of broad pharmacological nuclear import or export inhibitors
and obtained dose-dependent severe lengthening of the circadian period in U-2
OS reporter cells. As both nucleo-cytoplasmic pathways (import and export) are
crucial for circadian rhythm generation, we systematically tested the
necessity of individual components of the nucleo-cytoplasmic translocation
machinery for normal near-24-hour rhythm generation. To this end, we performed
RNAi-mediated knockdowns of 62 localization genes. Out of these, the
expression of 14 is essential for normal circadian dynamics. Among the three
components, whose knockdown led to period shortening, we identified
Transportin 1 (TNPO1), a non classical nuclear import carrier. Until now, no
data on TNPO1-mediated nucleo-cytoplasmic transport of circadian clock
proteins is available. Therefore, we investigated a potential function of
TNPO1 in nuclear import of circadian clock proteins. We show that the
alternative nuclear import carrier TNPO1 is crucial for normal circadian
rhythm generation as well as for normal nuclear PER1 accumulation. Upon
knockdown of tnpo1 expression, nuclear accumulation of PER1 but not PER2, is
reduced and its import is decelerated as determined by fluorescence recovery
after photobleaching. Furthermore, these effects are likely due to a direct
interaction between TNPO1 and PER1. Interestingly, we observed an increased
binding between TNPO1 and PER1 under oxidative stress conditions, indicating
TNPO1-dependent redox sensitivity of PER1 localization. To test this, we
investigated nuclear import rates and subcellular distribution upon hydrogen
peroxide treatment, which resulted in reduced as well as decelerated nuclear
accumulation of PER1. Further, impaired nuclear PER1 import likely depends on
TNPO1 as the oxidative stress in tnpo1-depleted cells did neither result in a
stronger decrease of PER1 nuclear accumulation than the single treatments nor
was the nuclear import further decelerated. With this study, we present
evidence for an alternative nuclear import pathway for circadian clock
proteins, which is essential for normal near-24-hour rhythm generation. Upon
perturbation of this TNPO1-mediated nuclear entry, nuclear accumulation of
PER1 (but not PER2) is decreased, indicating a specific nuclear translocation
pathway for distinct circadian clock proteins. Furthermore, the alternative
nuclear import carrier TNPO1 might be an additional component of the mutual
regulation between redox conditions and the circadian clock.
de
dc.description.abstract
In fast allen Organismen ermöglichen intrinsische circadiane Uhrmechanismen,
durch zellautonome Transkriptions-Translations-Rückkopplungsschleifen, die
Anpassung an tageszeitabhängige Veränderungen. In Säugetieren bilden CLOCK und
BMAL1-Heterodimere die transkriptionellen Aktivatoren der molekularen Uhr,
welche spezifisch an Enhancer-Elemente in der Promoterregion ihrer Zielgene
binden. Dadurch aktivieren sie u.a. die Expression von Cryptochrom (Cry1/2)
und Period (Per1-3), welche im Zytoplasma translatiert und modifiziert werden.
Um CLOCK/BMAL1 im Nukleus zu inhibieren, müssen PER und CRY zurück in den Kern
translozieren. Während eine Stabilisierung von PER- und CRY-Proteinen deren
Kernimport ermöglicht, führt die Destabilisierung der transkriptionellen
Repressoren zu deren Abbau. Obwohl bekannt ist, dass die PER- und CRY-
Stabilität durch Phosphorylierung und Ubiquitinierung reguliert wird, ist
unser Wissen über den genauen Translokationsmechanismus durch die Kernpore
sehr begrenzt. Proteine mit einem Molekulargewicht größer als 40 kDa, so auch
PER und CRY, müssen aktiv in den Kern transportiert werden. Die meisten
Proteine werden dabei durch die sogenannten „klassischen“ nukleären Importine
(nukleäre Import-Transporter), Importin α und β, in den Kern transloziert.
Dazu erkennen und binden die Transporter spezifische (klassische)
Kernlokalisationssignale (cNLS) in ihren Cargos. Zielgerichtete Mutagenese von
Uhrprotein-spezifischen cNLS, sowie die RNA-Interferenz (RNAi)-basierende
Störung des klassischen nukleären Importwegs verringert die nukleäre
Anreicherung von Uhrproteinen. Darüber hinaus führt eine verminderte Importin
β-Expression zu einer Verlängerung der circadianen Periode. Bis jetzt
fokussierten sich Untersuchungen des Kernimports von Uhrproteinen
ausschließlich auf den klassischen nukleären Importweg, obwohl mehr als 60
verschiedene Proteine am gesamten nukleo-zytoplasmatischen
Translokationsapparat beteiligt sind. Der Umfang dieses Multiproteinnetzwerkes
weist auf ein weitaus komplexeres Regulationssystem des nukleo-
zytoplasmatischen Transports von Uhrproteinen hin. Bis heute gibt es keinen
systematischen Ansatz, um den Einfluss des nukleo-zytoplasmatischen
Transportapparates auf die Generierung von circadianer Rhythmen zu
untersuchen. Aus diesem Grund haben wir zunächst die Wirkung von
pharmakologischen Kernimport- und -exportinhibitoren untersucht und eine
dosisabhängige Verlängerung der circadianen Periode in U-2 OS Reporterzellen
beobachten. Daraus schlussfolgern wir, dass sowohl nukleärer Import als auch
Export für die Generierung normaler circadianer Rhythmen essentiell sind. Um
die Notwendigkeit einzelner Komponenten des nukleo-zytoplasmatischen
Transportapparates für die Generierung einer normale ~24 Stunden-Periode zu
untersuchen, haben wir einzeln die Transkripte von 62 Komponenten des Kern-
Translokationsapparates durch RNAi-depletiert. Dadurch konnten wir 14
Transkripte identifizieren, die notwendig für eine normale circadiane Periode
sind. Unter den drei Komponenten, deren Knockdown zu einer Verkürzung der
circadianen Periode führte, befand sich auch Transportin 1 (Tnpo1), ein nicht-
klassisches Importin. Derzeit gibt es keine Informationen zu einem
TNPO1-basierenden nukleären Import von Uhrproteinen. Deshalb haben wir den
potentiell TNPO1-abängigen Kernimport von Uhrproteinen untersucht. Unsere
Daten weisen darauf hin, dass TNPO1 als alternatives Importin sowohl für die
Generierung normaler circadianer Rhythmen als auch für eine normale nukleäre
PER1-Lokalisation notwendig ist. Der Knockdown von Tnpo1-Transkripten führt
dabei sowohl zur Reduktion nukleärer PER1-Level, als auch zu einem verzögerten
Kernimport von PER1. Zusätzliche Bindungsstudien zeigen, dass diese Effekte
wahrscheinlich auf eine direkte Interaktion der beiden Proteine zurückzuführen
sind. Im Gegensatz zu PER1, führte ein Knockdown der Tnpo1-Level zu keiner
Veränderung der subzelluläre PER2-Verteilung und -Kernimportrate.
Interessanterweise haben wir eine verstärkte Bindung von TNPO1 und PER1 unter
oxidativen Stressbedingungen festgestellt, was auf eine TNPO1-abhängige Redox
Sensitivität der PER1-Lokalisation hinweisen könnte. Die Induktion von
oxidativem Stress führte zu einer reduzierten und verzögerten nukleären
Akkumulation von PER1. Zusätzlich weisen unsere Daten darauf hin, dass dieser
Mechanismus TNPO1-abhängig ist, da die Reduktion der nukleären PER1-Level
durch Induktion von oxidativer Stress in Tnpo1-herunterregulierten Zellen
nicht stärker ist als die der separaten Behandlungen. Mit dieser Studie wurden
erstmals Hinweise auf einen alternativen nukleären Import von Uhrproteine
gewonnen, welcher essentiell für die Generierung normaler circadianer Rhythmen
ist. Durch den Knockdown dieses TNPO1-basierenden Kernimports wird die
nukleäre Akkumulation von PER1, jedoch nicht von PER2 verringert. Dies deutet
auf einen spezifischen nukleären Importprozess für ausgewählte Uhrproteine
hin. Darüber hinaus könnte TNPO1 eine zusätzliche Komponente für die
gegenseitige Regulation der Redox Homöostase und der circadianen Uhr sein.
de
dc.format.extent
xviii, 143, LXXXIII Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
nuclear import
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::500 Naturwissenschaften
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
A non-conventional nuclear import pathway for circadian clock proteins
dc.contributor.contact
korge.sandra@gmx.net
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Achim Kramer
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Florian Heyd
dc.date.accepted
2016-11-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000103667-0
dc.title.translated
Ein nicht-konventioneller nukleärer Importweg für zirkadiane Uhrproteine
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000103667
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000020536
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access