In almost all vertebrate species, the adaptation to daily environmental changes is enabled by intrinsic clock mechanisms, which are constituted of cell-autonomous transcriptional-translational feedback loops (TTFLs). In mammals, those molecular clocks are composed of the heterodimeric transcriptional activators CLOCK and BMAL1, which bind to enhancer-elements in the promoter region of their target genes such as cryptochrome (cry1 2) and period (per1-3). CRY and PER undergo post-translational modifications in the cytoplasm prior to inhibition of CLOCK/BMAL1 in the nucleus. To repress transcription, PER and CRY proteins need to translocate back into the nucleus. Although, it is known that phosphorylation and ubiquitination control the fate of CRYs and PERs, triggering either their degradation or nuclear translocation, our understanding of the actual nuclear entry process through nuclear pores is limited. Proteins lager than 40 kDa such as PERs and CRYs depend on active nucleocytoplasmic translocation. The predominant, “classical” nuclear import is executed by Importin α and β, which recognize so called classical nuclear localization signals (cNLS). Site-directed mutagenesis of circadian clock-derived cNLSs as well as RNAi-mediated perturbation of the classical nuclear import carriers decrease nuclear accumulation of circadian clock proteins. In addition, the reduction of importin β transcript levels lengthens the circadian period. Yet, up to now studies focused only on the classical nuclear import of circadian clock proteins, whereas more than 60 different proteins comprise the nucleo-cytoplasmic translocation machinery, suggesting a much more complex regulatory system. Until now, no systematic approach was executed to investigate the impact of the nucleo-cytoplasmic translocation machinery on circadian rhythm dynamics. Therefore, we first examined the influence of nuclear import and export on the circadian clock upon application of broad pharmacological nuclear import or export inhibitors and obtained dose-dependent severe lengthening of the circadian period in U-2 OS reporter cells. As both nucleo-cytoplasmic pathways (import and export) are crucial for circadian rhythm generation, we systematically tested the necessity of individual components of the nucleo-cytoplasmic translocation machinery for normal near-24-hour rhythm generation. To this end, we performed RNAi-mediated knockdowns of 62 localization genes. Out of these, the expression of 14 is essential for normal circadian dynamics. Among the three components, whose knockdown led to period shortening, we identified Transportin 1 (TNPO1), a non classical nuclear import carrier. Until now, no data on TNPO1-mediated nucleo-cytoplasmic transport of circadian clock proteins is available. Therefore, we investigated a potential function of TNPO1 in nuclear import of circadian clock proteins. We show that the alternative nuclear import carrier TNPO1 is crucial for normal circadian rhythm generation as well as for normal nuclear PER1 accumulation. Upon knockdown of tnpo1 expression, nuclear accumulation of PER1 but not PER2, is reduced and its import is decelerated as determined by fluorescence recovery after photobleaching. Furthermore, these effects are likely due to a direct interaction between TNPO1 and PER1. Interestingly, we observed an increased binding between TNPO1 and PER1 under oxidative stress conditions, indicating TNPO1-dependent redox sensitivity of PER1 localization. To test this, we investigated nuclear import rates and subcellular distribution upon hydrogen peroxide treatment, which resulted in reduced as well as decelerated nuclear accumulation of PER1. Further, impaired nuclear PER1 import likely depends on TNPO1 as the oxidative stress in tnpo1-depleted cells did neither result in a stronger decrease of PER1 nuclear accumulation than the single treatments nor was the nuclear import further decelerated. With this study, we present evidence for an alternative nuclear import pathway for circadian clock proteins, which is essential for normal near-24-hour rhythm generation. Upon perturbation of this TNPO1-mediated nuclear entry, nuclear accumulation of PER1 (but not PER2) is decreased, indicating a specific nuclear translocation pathway for distinct circadian clock proteins. Furthermore, the alternative nuclear import carrier TNPO1 might be an additional component of the mutual regulation between redox conditions and the circadian clock.
In fast allen Organismen ermöglichen intrinsische circadiane Uhrmechanismen, durch zellautonome Transkriptions-Translations-Rückkopplungsschleifen, die Anpassung an tageszeitabhängige Veränderungen. In Säugetieren bilden CLOCK und BMAL1-Heterodimere die transkriptionellen Aktivatoren der molekularen Uhr, welche spezifisch an Enhancer-Elemente in der Promoterregion ihrer Zielgene binden. Dadurch aktivieren sie u.a. die Expression von Cryptochrom (Cry1/2) und Period (Per1-3), welche im Zytoplasma translatiert und modifiziert werden. Um CLOCK/BMAL1 im Nukleus zu inhibieren, müssen PER und CRY zurück in den Kern translozieren. Während eine Stabilisierung von PER- und CRY-Proteinen deren Kernimport ermöglicht, führt die Destabilisierung der transkriptionellen Repressoren zu deren Abbau. Obwohl bekannt ist, dass die PER- und CRY- Stabilität durch Phosphorylierung und Ubiquitinierung reguliert wird, ist unser Wissen über den genauen Translokationsmechanismus durch die Kernpore sehr begrenzt. Proteine mit einem Molekulargewicht größer als 40 kDa, so auch PER und CRY, müssen aktiv in den Kern transportiert werden. Die meisten Proteine werden dabei durch die sogenannten „klassischen“ nukleären Importine (nukleäre Import-Transporter), Importin α und β, in den Kern transloziert. Dazu erkennen und binden die Transporter spezifische (klassische) Kernlokalisationssignale (cNLS) in ihren Cargos. Zielgerichtete Mutagenese von Uhrprotein-spezifischen cNLS, sowie die RNA-Interferenz (RNAi)-basierende Störung des klassischen nukleären Importwegs verringert die nukleäre Anreicherung von Uhrproteinen. Darüber hinaus führt eine verminderte Importin β-Expression zu einer Verlängerung der circadianen Periode. Bis jetzt fokussierten sich Untersuchungen des Kernimports von Uhrproteinen ausschließlich auf den klassischen nukleären Importweg, obwohl mehr als 60 verschiedene Proteine am gesamten nukleo-zytoplasmatischen Translokationsapparat beteiligt sind. Der Umfang dieses Multiproteinnetzwerkes weist auf ein weitaus komplexeres Regulationssystem des nukleo- zytoplasmatischen Transports von Uhrproteinen hin. Bis heute gibt es keinen systematischen Ansatz, um den Einfluss des nukleo-zytoplasmatischen Transportapparates auf die Generierung von circadianer Rhythmen zu untersuchen. Aus diesem Grund haben wir zunächst die Wirkung von pharmakologischen Kernimport- und -exportinhibitoren untersucht und eine dosisabhängige Verlängerung der circadianen Periode in U-2 OS Reporterzellen beobachten. Daraus schlussfolgern wir, dass sowohl nukleärer Import als auch Export für die Generierung normaler circadianer Rhythmen essentiell sind. Um die Notwendigkeit einzelner Komponenten des nukleo-zytoplasmatischen Transportapparates für die Generierung einer normale ~24 Stunden-Periode zu untersuchen, haben wir einzeln die Transkripte von 62 Komponenten des Kern- Translokationsapparates durch RNAi-depletiert. Dadurch konnten wir 14 Transkripte identifizieren, die notwendig für eine normale circadiane Periode sind. Unter den drei Komponenten, deren Knockdown zu einer Verkürzung der circadianen Periode führte, befand sich auch Transportin 1 (Tnpo1), ein nicht- klassisches Importin. Derzeit gibt es keine Informationen zu einem TNPO1-basierenden nukleären Import von Uhrproteinen. Deshalb haben wir den potentiell TNPO1-abängigen Kernimport von Uhrproteinen untersucht. Unsere Daten weisen darauf hin, dass TNPO1 als alternatives Importin sowohl für die Generierung normaler circadianer Rhythmen als auch für eine normale nukleäre PER1-Lokalisation notwendig ist. Der Knockdown von Tnpo1-Transkripten führt dabei sowohl zur Reduktion nukleärer PER1-Level, als auch zu einem verzögerten Kernimport von PER1. Zusätzliche Bindungsstudien zeigen, dass diese Effekte wahrscheinlich auf eine direkte Interaktion der beiden Proteine zurückzuführen sind. Im Gegensatz zu PER1, führte ein Knockdown der Tnpo1-Level zu keiner Veränderung der subzelluläre PER2-Verteilung und -Kernimportrate. Interessanterweise haben wir eine verstärkte Bindung von TNPO1 und PER1 unter oxidativen Stressbedingungen festgestellt, was auf eine TNPO1-abhängige Redox Sensitivität der PER1-Lokalisation hinweisen könnte. Die Induktion von oxidativem Stress führte zu einer reduzierten und verzögerten nukleären Akkumulation von PER1. Zusätzlich weisen unsere Daten darauf hin, dass dieser Mechanismus TNPO1-abhängig ist, da die Reduktion der nukleären PER1-Level durch Induktion von oxidativer Stress in Tnpo1-herunterregulierten Zellen nicht stärker ist als die der separaten Behandlungen. Mit dieser Studie wurden erstmals Hinweise auf einen alternativen nukleären Import von Uhrproteine gewonnen, welcher essentiell für die Generierung normaler circadianer Rhythmen ist. Durch den Knockdown dieses TNPO1-basierenden Kernimports wird die nukleäre Akkumulation von PER1, jedoch nicht von PER2 verringert. Dies deutet auf einen spezifischen nukleären Importprozess für ausgewählte Uhrproteine hin. Darüber hinaus könnte TNPO1 eine zusätzliche Komponente für die gegenseitige Regulation der Redox Homöostase und der circadianen Uhr sein.
