Untersuchungen zu diagnostischen und therapeutischen Aspekten der Telomerase beim Nierenzellkarzinom

Abstract

Aufgrund bisher mangelnder therapeutischer Möglichkeiten beim fortgeschrittenen Nierenzellkarzinom boten sich Untersuchungen zur Telomerase in dieser chemoresistenten und heterogenen Tumorentität an. Die Telomerase ist ein Ribonukleoproteinkomplex bestehend aus einer RNA-Komponente (hTR) und einer katalytischen Proteinuntereinheit (hTERT). In zwei verschiedenen Versuchsserien wurde Telomeraseaktivität von Nierenkarzinomen bestimmt, 63 % bzw. 46 % wurde Telomeraseaktivität nachgewiesen. Normales Nierengewebe zeigte keine Telomeraseaktivität. Mit Hilfe einer quantitativen RT-PCR wurde in 34 % der Nierenkarzinome eine Expression der hTERT gefunden, Nierennormalgewebe waren zu 31 % hTERT positiv. Eine hTR-Expression wurde in 83 % der Nierenkarzinome gefunden, aber nur in 56 % der Nierennormalgewebe. In der Expression der Telomeraseuntereinheiten treten keine signifikanten Unterschiede zwischen Tumor- und Normalgewebe auf. Es konnte aber eine statistisch signifikante Korrelation zwischen hTERT und der Telomeraseaktivität (p=0,031) aufgezeigt werden. Für die Hemmung der Telomerase wurde als Modell die Nierenkarzinomzelllinie der Maus RENCA verwendet. Es wurden drei Angriffsstrategien an dem Enzymkomplex untersucht: (i) die Verwendung von antisense Telomerase-RNA gerichtet gegen die RNA; (ii) eine dominant-negative Mutante der katalytischen Untereinheit und (iii) der Einsatz von chimären Oligonukleotiden, die eine Bindung an die Telomerase-RNA und an die Proteinuntereinheit ermöglichen. In den murinen oder humanen Tumorzellen wurde eine zeitweise Hemmung der Proliferation und ein erhöhter Zelltod hervorgerufen. Ungefähr 35. Populationsverdopplungszeiten nach Behandlung der RENCA-Zellen mit antisense Telomerase-RNA wurde eine stark verringerte Proliferation, sowie eine gehemmte Telomeraseaktivität beobachtet. Dies war einhergehend mit der Verkürzung der Telomere. Bei der Verwendung einer dominant-negativen Mutante der katalytischen Untereinheit zeigte sich nach einer stark verringerten Selektionsrate der transduzierten Klone eine bis zu 30 % gehemmte Proliferation der veränderten Zellen. Weiterhin wurde auch in diesen Zellen eine verringerte Telomeraseaktivität, sowie eine Verkürzung der Telomere bis zur 86. PD gemessen. Nach der Hemmung der Telomeraseaktivität wurde eine Reaktivierung der Telomerase aufgrund einer gesteigerten Expression des endogenen Telomeraseproteins gemessen. Weiterhin konnte die Telomeraseaktivität durch den Einsatz von verschiedenen Phosphorthioat- modifizierten Oligonukleotiden in humanen und murinen Tumorzelllinien in-vitro gehemmt werden. Diese hier vorgestellten Ergebnisse zeigen neue Möglichkeiten der Hemmung der Telomerase in Tumorzellen auf. Die Ergebnisse machen deutlich, dass die Telomerase einer komplexen Regulation in der Zelle unterliegt, bemerkenswert dabei sind, die unterschiedlichen Expressionsstärken und -muster, sowie die gewebe- und zellspezifischen Besonderheiten, besonders zwischen Maus und Mensch. Die Telomerase besitzt zusammen mit anderen alternativen Mechanismen eine Bedeutung für die Telomererhaltung, stellt aber kein diagnostisches Target dar. Die vorliegenden Untersuchungen zur Telomerase beim Nierenzellkarzinom weisen zusammenfassend auf mögliche neue Wege in der Tumordiagnostik und Tumortherapie hin.

The enzyme telomerase is a ribonucleoprotein DNA polymerase composed of an RNA molecule, TR (Telomerase RNA) and a catalytic subunit, TERT (Telomerase Reverse Transcriptase). Renal cell cancer is known as an chemo resistant and heterogeneous tumor entity. Examinations of telomerase were undergone to investigate possible therapeutic paths against advanced renal cell cancer. Telomerase activity was measured in two different series of renal carcinoma and were detected in 63 % and 46% respectively. No samples of normal renal tissue showed telomerase activity. For a real-time RT-PCR of hTR RNA and hTERT mRNA we used the LightCycler quantification technology. We detected in only 34% of the carcinoma tissue an expression of hTERT, compared to normal tissue there we found expression in 31% of samples. For hTR expression 83% of clear cell carcinoma samples were positive. Normal renal tissue showed in 56% an expression of hTR. No correlation between the expression of telomerase subunits could be found. But a statistically significant correlation (p<0.031) between expression of the telomerase catalytic subunit hTERT with telomerase activity in renal cell carcinoma was established. To investigate telomerase inhibition we used the murine renal cancer cell line RENCA. We used three different strategies to study the enzyme complexes: (i) antisense-RNA directed against the telomerase RNA, (ii) an dominant-negative mutant of the catalytic subunit TERT and (iii) a chimaric oligonucleotide which binds to telomerase- RNA and the telomerase protein subunit. Both, human and murine tumor cells showed time-restricted inhibition of proliferation and an increased cell death in all three cases. After treatment of about 35 population doublings of RENCA cells we observed decreased proliferation as well as inhibition of telomerase activity. Telomerase inhibition leads to telomere shortening and telomere instabilities. Here we showed the effect of endogenous up regulation of the TERT protein resolved in overcoming telomerase inhibition through the dominant-negative mutant of TERT. In summary, these results suggests that telomerase is the subject of complex cell regulation. We assume that different expression and expression patterns of all telomerase compounds as well as tissue and cell-specific features are responsible for the differences of telomerase in mouse and human. Especially for renal cell carcinoma alternative mechanisms for telomere stabilization are well described. The results indicate that telomerase will be a possible new and interesting target in tumor diagnostic and tumor therapy.