Isolation, identification and typing of Brucella species as zoonotic pathogens by using conventional and molecular biological methods

Abstract

Representative studies from countries including North Africa, the Middle East, and India which are neighbours or are important trading partners of the European Union and on trade animals and their product. In our review, published data on seroprevalence of brucellosis from 1948 to 2009 were retrieved. Based on the collected literature, we found that new seroprevalence data are needed urgently to evaluate the current situation and for continuous monitoring of necessary control programs. Sera of 895 apparently healthy Camels (Camelus dromedaries) in addition to 5 human samples from Central Veterinary Research Laboratory (CVRL); Dubai, UAE was investigated. Rose Bengal Test (RBT), Complement Fixation Test (CFT), Slow Agglutination Test (SAT), Competitive Enzyme Linked Immunosorbant Assay (cELISA) and Fluorescence Polarization Assay (FPA) as well as real-time PCR were used. Our findings revealed that bcsp31 kDa real-time PCR detected Brucella DNA in 84.8% (759/895) of the examined samples, of which 15.5% (118/759) were serologically negative. Species specific real-time PCR system revealed that only Brucella abortus was present in the camels investigated in this study. A probit analysis revealed that real-time PCR assay detect as little as 23fg of Brucella DNA per reaction with a probability of 95%. Our results show no relevant difference in sensitivity between the different serological tests. FPA detected the highest number of positive cases (79.3%) followed by CFT (71.4%), RBT (70.7%), SAT (70.6%) and cELISA (68.8 %). A perfect agreement between CFT, RBT and SAT was proven by calculating Kappa values but sensitivity of all tests is low when compared to FPA or real-time PCR. A combination of real-time PCR with one of the used serological tests identified brucellosis in more than 99 % of the infected animals. 59.7% of the examined samples were positive in all serological tests and real-time PCR. On the other hand, Brucella spp was also isolated from animal handler. The percentage of positive cases among the examined samples were 60, 100, 80, 80,100 by using RBT, cELISA, CFT, SAT, FPA, respectively. On the other hand, real-time PCR detected infection among 40% from the examined samples and those samples were also positive in most of the used serological tests. Species specific real- time PCR revealed that the infection in human cases was also due to B. abortus. This result confirmed the hazards associated with occupational exposure through direct contact with infected animals. A total of 46 B. melitensis isolate obtained from sheep and human from Turkey were studied. From which, 20 were isolated from aborting ewes in 124 different sheep flocks in Van Province, East Anatolia in Turkey during lambing seasons 2004-2005, 2005-2006 and 2006-2007, as well as 26 strains from German tourists were isolated in Germany and were sent to the National Reference Laboratory, were also included in this study. They were collected during 2004 to 2010. Our investigation was amended with recently published data for 41 B. melitensis isolates from German tourists (Al Dahouk et al., 2007b). The 67 human B. melitensis strains isolated in Germany and the 20 sheep isolates from Turkey, Southeast Anatolia were clustered in 68 different genotypes based on the differences in the numbers of repeat units at 16 VNTR loci. It is concluded that brucellosis is highly prevalent in sheep and humans in several district in Turkey.

In einer Übersicht wurden Veröffentlichungen zur Seroprävalenz von Brucellose bei Tieren aus Nordafrikanischen Ländern, aus Ländern des Mittleren Ostens und Indien ausgewertet. Diese Länder sind entweder wichtige Handelspartner der EU oder grenzen direkt an diese an. Berücksichtigt wurde ein Zeitraum von 1948 bis 2009. Dabei wurde festgestellt, dass v.a. Daten aus dem letzten Jahrzehnt fehlen und deshalb eine Beurteilung der aktuellen Brucellose-Situtation in diesen Ländern nicht möglich ist. Ebenso lässt sich keine Ausage zum Erfolg der dort durchgeführten Kontrollprogramme zum jetzigen Zeitpunkt machen. In einer Studie zur Verbreitung von Brucellose bei Kamelen (Camelus dromedarius) wurden 895 Seren von klinisch gesunden Kamelen, die vom Central Veterinary Research Laboratory in Dubai zur Verfügung gestellt wurden, untersucht. Zusätzlich wurden fünf Humanseren in die Untersuchung eingeschlossen. Zur Anwendung kamen: Rose Bengal-Test (RBT), Komplement Fixations-Test (CFT), Langsam Agglutinations-Test (SAT), Competitiver ELISA (cELISA), das ‚Fluorescence Polarization Assay’ (FPA) sowie eine real-time PCR. Dabei wies die genus-spezifische bcsp31 kDa real-time PCR in 84, 8% (759/895) der Proben Brucella DNA nach, wobei 15,5% (118/759) der Seren vorher serologisch negativ befundet wurden. Eine species-spezifische real-time PCR bewies, dass nur Brucella abortus DNA in den Proben vorhanden war. Eine sogenannte ‚Probit- Analyse’ ermittelte, dass die verwendete PCR 23fg Brucella DNA in eine Probe mit eine Sicherheit von 95% nachwies. Die verschiedenen serologischen Testsysteme zeigten keinerlei gravierende Unterschiede in Sensitivität oder Spezifität. Der FPA identifizierte die meisten positiven Seren (79,3%) gefolgt von CFT (71,4%), RBT (70,7%), SAT (70,6%) und cELISA (68,8 %). Eine perfekte Übereinstimmung der Kennwerte gab es zwischen CFT, RBT und SAT, wie mit dem Kappa Test gezeigt werden konnte. Allerdings sind die Sensitivitäten von CFT, RBT, SAT und cELISA sehr niedrig, wenn man sie mit denen von FPA oder PCR vergleicht. Eine Kombination aus real-time PCR mit einem der untersuchten serologischen Tests kann Brucellose in mehr als 99 % der untersuchten Tiere identifizieren. 59,7% der untersuchten Proben waren positiv in allen serologischen Tests und der PCR. Betrachtet man die Anzahl der positiven Tiere gestaffelt nach den verwendeten Tests, so waren diese positiv in 60% der Fälle mit RBT, in 100% mit dem cELISA, in 80% mit dem CFT, in 80% mit dem SAT und in 100% mit dem FPA. Die real-time PCR bewies das Vorhandensein von Brucellose bei 40% der untersuchten Tiere, wobei diese Tiere auch regelmässig mit serologischen Tests positiv getestet wurden. Auch bei den humanen Seren konnte B. abortus DNA nachgewiesen werden. Diese Untersuchung zeigt die grosse Gesundheitsgefährdung für den Menschen, der in Kontakt mit selbst nicht klinisch erkrankten Kamelen kommt. In einer Studie zum epidemiologischen Kontext zwischen von Patienten in Deutschland (türkische Migranten und Touristen) isolierten Brucella melitensis Stämmen und Stämmen, die von türkischen Schafen aus der Ost-Anatolischen Provinz Van stammten, kamen 26 Stämme humanen und 20 ovinen Ursprungs zur Untersuchung. Die Schaf-Stämme waren während der Ablammsaison 2004 – 2005, 2005-2006 und 2006-2007 aus 124 Herden isoliert worden. Die deutschen Stämme waren in der Zeit von 2004 bis 2010 an das Nationale Referenzlabor für Brucellose zur Typisierung eingesandt worden. Zusätzlich konnte auf Datensätze aus einer Publikation von Al Dahouk et al. von 2007 zurückgegriffen werden, in der weitere 41 B. melitensis Stämme des NRLs mit türkischem Ursprung mittels molekularer Typisierung untersucht worden waren. Die angewendete Multi Locus Variable Number of Tandem Repeats Analyse erbrachte insgesamt 68 unterschiedliche, wobei mehrere Human- und Schafstämme sogar identische Genotypen aufwiesen. Diese Untersuchung zeigt, dass Brucellose in der Türkei immer noch endemisch vorkommt und durch ‚Touristen’ in nicht endemische, europäische Länder wie z.B. Deutschland regelmässig eingeschleppt wird.