Hexokinase II-vermittelte Hypoxietoleranz und endogene Neuroprotektion

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es nachzuweisen, dass durch die Überexpression der Hexokinase II in primären Kortexneuronen ein Zustand ähnlich der endogenen Neuroprotektion und daraus resultierende Hypoxietoleranz induziert wird. Zunächst wurde hierzu ein Transfektionssystem zur Untersuchung protektiver Gene in primären Kortexneuronen etabliert. Basierend auf einem Elektroporationssystem (Nucleofection™) wurde hierbei mit einem Kotransfektions- / Kokultivierungsansatz unter Verwendung grüner und roter Fluoreszenzproteine sowie dem antiapoptosischen Gen BclXL als Positivkontrolle ein neues System zur Analyse potenziell neuroprotektiver Gene in transfizierten primären Kortexneuronen etabliert. Die transfizierten Zellen lassen sich bei diesem Ansatz durch die Markierung mit Fluoreszenzproteinen unabhängig von der Gesamtzellpopulation, bestehend aus überwiegend nicht transfizierten Neuronen, untersuchen. Mit diesem Kotransfektions- / Kokultivierungsansatz wurde der Effekt der Überexpression des glykolytischen Enzyms Hexokinase II auf das Überleben transfizierter primärer Kortexneurone unter hypoxischen Bedingungen untersucht. Hierbei zeigte sich ein Schutz der Hexokinase II-transfizierten Neurone vor hypoxischem Zelltod. Dieser Hexokinase II-vermittelte Schutz vor neuronalem Zelltod stellte sich als glukoseabhängig dar. Die Familie der Hexokinase-Isoenzyme, zu der die Hexokinase II gehört, phosphoryliert Glukose zu Glukose-6-Phosphat. Damit stellen die Hexokinasen Schlüsselenzyme des Glukosemetabolismus dar. Weiterhin gibt es seit einiger Zeit Hinweise auf eine Modulation der Apoptose durch die Hexokinase II. Da hierfür die mitochondriale Lokalisation der Hexokinase II von großer Bedeutung ist, wurde zum Abschluss der vorliegenden Arbeit mit einem genetischen Screeningverfahren nach neuen Interaktionspartnern der Hexokinase II an der äußeren Mitochondrienmembran gesucht. Hierbei wurden mit einem modifizierten Yeast-Two Hybrid-Assay erstmals Kandidaten, die an der Hexokinase II vermittelten Zelltodregulation beteiligt sein könnten, als direkte Interaktionspartner der Hexokinase II identifiziert. Die in der vorliegenden Arbeit charakterisierte neuroprotektive Wirkung der Hexokinase II stellt einen Ansatz für die Entwicklung neuer Konzepte für eine optimierte Schlaganfalltherapie dar. Die Verbindung apoptotischer Regulationsprozesse mit Mechanismen des Glukosemetabolismus hat allerdings auch eine über das pathobiologische Verständnis der zerebralen Ischämie hinausgehende Bedeutung. Aufgrund der zentralen Rolle der Hexokinasen im Glukosemetabolismus aller Säugerzellen ist es möglich, dass die in dieser Arbeit beschriebenen Mechanismen der glukoseabhängingen Protektion vor Hypoxie induziertem apoptotischen Zelltod durch Hexokinase II und ihrer hier identifizierten Bindungspartner eine grundsätzliche biologische Relevanz besitzen. Hierdurch ergeben sich aufgrund des neuen Verständnisses der Hexokinase-abhängigen Apoptosemodulation u. A. auch Ansätze für eine Optimierung der Therapie verschiedener maligner Tumore, bei denen eine deutliche Überexpression der Hexokinase II zu beobachten ist.

This dissertation demonstrates that Hexokinase II when overexpressed in primary cortical neurons induces a state of hypoxia tolerance which is similar to endogenous neuroprotection. In order to analyse the effects of putative neuroprotective genes, a novel transfection-based approach was established in primary cortical neurons. This approach relies on cotransfection and subsequent cocultivation of neurons with green or red fluorescent proteins and the antiapoptotic gene BclXL. This approach enables the analysis of transfected neurons independent of the total population of cells. This cotransfection / cocultivation approach was used to investigate the effect of overexpressed Hexokinase II on neuronal survival under hypoxic conditions. Hexokinase II mediated a glucose-dependent protection from neuronal cell death under hypoxic conditions. In order to screen for putative interactors of Hexokinase II at the outer mitochondrial membrane, a modified yeast-two hybrid assay was employed. The neuroprotective properties of Hexokinase II open opportunities for the development of novel forms of stroke treatment. Hexokinase II integrates the regulation of apoptosis and glucose metabolism.