Die Primase RepB’ des Plasmides RSF1010 initiiert jeweils an den Sequenzen ssiA und ssiB im oriV die RSF1010-Replikation, die ausschließlich im leading strand Modus erfolgt. Die beiden einzelsträngigen ssi Sequenzen bestehen aus 40 Nukleotiden und bilden Haarnadelstrukturen (nt 7-27) aus. In der vorliegenden Arbeit wurde bestimmt, dass RepB’ die Synthese eines DNA-Primers dATP-abhängig an Thymin 32 der ssiA-Sequenz beginnt. Die Raumstruktur von RepB’ wurde in Volllänge bei einer Auflösung von 2,0 Å und die Struktur der katalytischen Domäne von RepB’ (AS 1-212) im Komplex mit ssiA(3’Δ13)DNA (nt 1-27) bei einer Auflösung von 2,7 Å aufgeklärt. RepB’ zeigt eine hantelförmige Struktur, die aus einer N-terminalen katalytischen und einer C-terminalen Helix-Bündel Domäne besteht. Beide Domänen von RepB’ sind durch einen flexiblen Aminosäurelinker aus 14 Aminosäuren verknüpft und liegen in der Kristallstruktur ~29 Å voneinander entfernt. Die Struktur der katalytischen Domäne von RepB’ (AS 1-212) im Komplex mit ssiA(3’Δ13)DNA zeigt, dass die sechs 5’-terminalen Nukleotide und das erste Basenpaar der ssiA(3’Δ13)DNA spezifisch von der Unterdomäne I der katalytischen Domäne gebunden werden. EMSA-Studien belegten, dass das spezifisch gebundende 5’-Ende der ssiA DNA essentiell zur Bindung von ssiA DNA an RepB’ ist. Die RepB’-ssiA(3’Δ13)DNA- Struktur zeigt erstmals eine Primase im spezifischen Komplex mit DNA. Struktur-Funktionsanalysen demonstrierten, dass die katalytische Domänen von RepB’ und der eukaryontischen/archaebakteriellen Pri-Typ Primase Familie eine ähnliche Faltung aufweisen und untereinander konservierte katalytische Aminosäuren besitzen. Allerdings fehlt der katalytischen Domäne von RepB’ ein für die Pri-Typ Primase-Familie typisches Zink-Bindungselement, das vermutlich die Bindung an Matrizen-ssDNA unterstützt. Die spezifisch DNA-bindenden Aminosäuren von RepB’ sind in Pri-Typ Primasen nicht konserviert. Die Raumstruktur von RepB’ ist das erste Beispiel einer Zink-unabhängigen Primase- Struktur. Komplementationsstudien bewiesen, dass die Helix-Bündel Domäne der katalytischen Domäne von RepB’ Primaseaktivität verleiht. Die Helix-Bündel Domäne wird in keiner anderen Primase-Raumstruktur vorgefunden und tritt nur innerhalb von IncQ-Primasen auf. Aminosäuresequenzvergleiche zeigten, dass RepB’ der Vertreter einer eigenen Primaseklasse ist, die von IncQ und IncQ- ähnlichen Plasmiden kodiert wird, die ssiA- und ssiB Sequenzen tragen und hohe Sequenzidentität zu RSF1010 besitzen.
Primase RepB’ of plasmid RSF1010 initiates the replication of plasmid RSF1010 within the origin of vegetative replication (oriV) on sequences ssiA (ssi, single strand initiator) and ssiB. Replication of RSF1010 is carried out exclusively in leading strand mode. Sequences ssiA and ssiB consist of 40 nucleotides whilst nucleotides 7-27 form a double-stranded hairpin. This work shows that RepB’ synthesises DNA primers with a length of up to 14 nucleotides in a dATP dependent manner beginning on thymine 32 of ssiA DNA. The crystal structure of RepB’ was determined in full length at 2.0 Å resolution and the structure of the catalytic domain of RepB’ (amino acids 1-212) in a specific complex with ssiA(3’Δ13)DNA at 2.7 Å resolution. RepB’ has got a dumbbell like shape consisting of an N-terminal catalytic and a C-terminal helix-bundle domain. Both domains of RepB’ are separated by a long α-helix and a flexible linker composed of 14 amino acids and are found ~29 Å away from each other in the crystal structure of RepB’. The structure of the catalytic domain of RepB’ in complex with ssiA(3’Δ13)DNA shows that nucleotides one to six and base pair C7-G27 of the hairpin are specifically bound by subdomain I of the catalytic domain. EMSA-studies confirmed that the six 5’ terminal nucleotides of ssiA DNA are crucial for binding to RepB’. The structure of the catalytic domain- ssiA(3’Δ13)DNA complex shows for the first time a primase in a specific complex with DNA. Structure function analyses revealed that the catalytic domains of RepB’ and of the eucaryotic/ archaebacterial Pri-type primase family share a similar fold and conserved catalytic amino acids. However, the catalytic domain of RepB’ lacks the zinc binding element typical of Pri-Typ primases which is supposed to support DNA binding. The ssiA DNA binding amino acids of RepB’ are not conserved among Pri-Typ primases. The structure of RepB’ is the first structure of a zinc independent primase. Complementation studies demonstrated that the catalytic domain of RepB’ exhibits primase activity only in presence of the helix-bundle domain of RepB’, which occurs exclusively among primases encoded by IncQ and IncQ-like plasmids. Amino acid sequence comparisons showed that RepB′ is apparently the prototype of a distinct class of primases encoded by IncQ and IncQ-like plasmids with ssiA- and ssiB-like sequences, and exclusive leading-strand replication mode.
