Funktionale Analyse des Pseudosignalpeptids des Corticotropin-Releasing- Factor-Rezeptors 2a

Abstract

Der Corticotropin-Releasing-Factor-Rezeptor Typ 2a (CRF2aR) gehört zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass der CRF2aR am N-Terminus ein Pseudosignalpeptid besitzt, das im Gegensatz zu konventionellen Signalpeptiden nicht vom Rezeptor abgespalten wird, sondern am reifen Protein verbleibt. Das Pseudosignalpeptid ist im Verlauf der frühen Stufen der Rezeptor-Biogenese weder in der Lage, die naszierende Polypeptidkette zur Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER) zu dirigieren, noch den proteinleitenden Kanal im Translokon zu öffnen (Rutz et al., J. Biol. Chem. 281, 24910-2492., 2006). Das Pseudosignalpeptid des CRF2aR ist in der GPCR-Familie eine bisher einzigartige Proteindomäne. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, welche Bedeutung das Pseudosignalpeptid für die Rezeptorfunktion hat. Speziell wurde untersucht, ob diese Rezeptordomäne den Internalisierungsmechanismus, die Expression an der Zelloberfläche oder die Signaltransduktion des Rezeptors beeinflusst. Für alle Untersuchungen wurde als Vergleich der homologe CRF1R herangezogen, der über ein konventionelles, abspaltbares Signalpeptid verfügt. Experimente am Laser Scanning Mikroskop (LSM) zur Agonisten-induzierten Internalisierung ließen beim CRF2aR im Gegensatz zum CRF1R keine β-Arrestin-Rekrutierung zur Plasmamembran erkennen. Dies führte initial zu der Hypothese, dass das Pseudosignalpeptid einen Einfluss auf den Internalisierungsmechanismus haben könnte. In genaueren Untersuchungen konnte jedoch gezeigt werden, dass die Internalisierungskinetiken des CRF2aR und des CRF1R keinen signifikanten Unterschiede aufweisen, und dass das Fehlen der Rekrutierung von β-Arrestin beim CRF2aR höchstwahrscheinlich auf einem Detektionsproblem beruht, das auf eine stark verminderte Oberflächenexpression des CRF2aR zurückzuführen ist. In der Folge wurde daher untersucht, ob und auf welcher Stufe das Vorhandensein des Pseudosignalpeptids des CRF2aRs die Expression des Rezeptors an der Plasmamembran beeinflusst. In der Tat konnte mit Signalpeptid- Austauschexperimenten zwischen dem CRF1R und dem CRF2aR belegt werden, dass das Vorhandensein des Pseudosignalpeptids zu einer sehr niedrigen Rezeptorexpression an der Zelloberfläche führt. Das Pseudosignalpeptid führt zu einer Zunahme der Expression unreifer Formen im ER und in der Folge zu einer verstärkten Interaktion des Rezeptors mit dem Chaperonprotein Calnexin. In der Summe löst das Pseudosignalpeptid dadurch eine verstärkte Retention des Rezeptors durch das Qualitätskontrollsystem des frühen sekretorischen Wegs aus - offensichtlich erschwert das Vorhandensein des Signalpeptids die korrekte Faltung des Rezeptors. Diese Daten erklären die verminderte Expression in der Plasmamembran. Alle beschriebenen Eigenschaften des Pseudosignalpeptids konnten durch dessen Transfer auf den CRF1R übertragen werden. Umgekehrt bewirkte der Transfer des konventionellen Signalpeptids des CRF1R auf den CRF2aR eine verbesserte Rezeptorfaltung und eine Erhöhung der Rezeptorexpression in der Plasmamembran. Ob der Pseudosignalpeptid-bedingten niedrigen CRF2aR-Expression in der Plasmamembran eine physiologische Bedeutung zukommt, ist noch unklar. Untersuchungen zur Signaltransduktion zeigten, dass die Aktivierung des CRF2aR zu einer sigmoiden cAMP-Konzentrations- Wirkungskurve führt, die auf eine ausschließliche Aktivierung von Gαs zurückzuführen ist. Die Aktivierung des CRF1R führte dagegen zu einer glockenförmige Konzentrations-Wirkungskurve – dieser Rezeptor koppelt bei niedriger Besetzung an Gαs und bei hoher Besetzung auch an Gαi. Die Ergebnisse für den CRF2aR und den CRF1R waren unabhängig von der Expression in der Plasmamembran und vom verwendeten Agonisten. Die Effekte konnten wiederum mit Signalpeptid-Austauschexperimenten zwischen beiden Rezeptorsubtypen übertragen werden, d.h. das veränderte Kopplungsverhalten ist auf die Signalpeptide zurückzuführen. Mit anderen Worten, die Anwesenheit des Pseudosignalpeptids verhindert die Kopplung des Rezeptors mit Gαi so dass nur noch eine Interaktion mit Gαs möglich ist. Zusammengefasst zeigen diese Untersuchungen, dass das Pseudosignalpeptid des CRF2aR nicht nur einen Einfluss auf die frühe Rezeptor-Biogenese im ER und damit auf die Rezeptorexpression in der Plasmamembran hat, sondern auch die G-Protein-Selektivität des Rezeptors mitbestimmt. Damit konnten dieser neuen GPCR-Domäne eindeutige Funktionen zugewiesen werden.

The corticotropin-releasing factor receptor type 2a (CRF2aR) belongs to the family of G protein-coupled receptors (GPCR). Previous work showed that the CRF2aR possesses an N-terminal pseudo signal peptide that remains uncleaved in contrast to conventional signal peptides. The pseudo signal peptide is neither capable to direct the nascent polypeptide to the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) during the course of the early steps of receptor biogenesis, nor to open the protein conducting channel in the translocon (Rutz et al., J. Biol Chem. 281, 24910-2492, 2006). Hence, the pseudo signal peptide of the CRF2aR is a unique protein domain in the GPCR family. The present study addresses the functional significance of the pseudo signal peptide. Specifically, it was investigated whether this receptor domain affects the internalization, the cell surface expression and the signal transduction. The homologous CRF1R, that possesses a conventional cleavable signal peptide, was used as control. Laser Scanning Microscope (LSM) experiments showed that CRF2aR, in contrast to CRF1R, did not lead to β-arrestin recruitment to the plasma membrane in agonist-induced internalization. This led to the assumption that the pseudo signal peptide might have an influence on the internalization mechanism. However, it turned out that the internalization kinetics of CRF2aR and CRF1R do not differ significantly. The lack of β-arrestin recruitment by CRF2aR is most likely due to a detection problem since the CRF2aR displayed a significantly reduced surface expression. Subsequently, it was investigated whether and at what stage of intracellular receptor transport the presence of the pseudo signal peptide influences the plasma membrane expression. Signal peptide exchange experiments between CRF1R and CRF2aRs, showed that the presence of the pseudo signal peptide indeed results in a very low receptor expression on the cell surface. The presence of the pseudo signal peptide results in an increased expression of immature receptor proteins in the ER, and consequently in an increased interaction of the receptor with the chaperone protein calnexin. Thus, the pseudo signal peptide causes an enhanced retention of the receptor by the quality control system in the early secretory pathway. The presence of the signal peptide apparently impairs the proper folding of the receptor. These data explain the decreased expression at the plasma membrane. All specified characteristics mediated by the pseudo signal peptide were entirely transferable to the CRF1R in signal peptide exchange experiments. Accordingly, the transfer of the conventional signal peptide of CRF1R to CRF2aR caused improved folding of the receptor and led to an increase in receptor expression in the plasma membrane. Whether the low CRF2aR expression in the plasma membrane induced by the pseudo signal peptide does play a physiological role is still unclear. Signal transduction studies showed that activation of CRF2aR leads to a sigmoidal cAMP-concentration-response curve through the exclusive activation of Gαs. In contrast to this, the activation of CRF1R, leads to a bell-shaped concentration-response curve. CRF1R couples to Gαs at low agonist concentration and to both Gαs and Gαi at high agonist concentration. These results for CRF2aR and CRF1R were independent of plasma membrane expression and applied agonist. Again, these effects could be shifted between the two receptor subtypes by signal peptide exchange experiments, i.e. the changes in coupling characteristics are due to the signal peptides. In other words, the presence of the pseudo signal peptide prevents the coupling of the receptor to Gαi, meaning that only an interaction with Gαs is possible. Taken together, these studies indicate that the signal peptide of the pseudo CRF2aR does not only affect the early receptor biogenesis in the ER, and thus the receptor expression in the plasma membrane, but also determines the G-protein selectivity of the receptor. Thus, unique functions could be assigned to this novel GPCR domain.