Influence of High Dietary Zinc on Structure and Selected Functional Aspects of Intestinal Microbial Communities in Piglets

Abstract

The development of new feeding strategies to maintain gut health in newly- weaned pigs, in order to minimize the use of antimicrobial compounds such as antibiotic growth promoters has become essential to avoid the emergence of antibiotic resistant bacteria. Since the late 1980s, the use of pharmacological concentrations of zinc oxide (ZnO) was studied to prevent diarrhea and increased growth rates in weaning piglets (Chapter 1). In Chapter 2 a summary of the literature on gut microbiota – host interactions and zinc as feed additive is given. The main objective of this thesis was to investigate the pig gut microbiota under the influence of high dietary ZnO to improve our knowledge for structural and functional aspects of gut microbial communities and to estimate new feeding strategies to substitute antibiotic growth promoters. Detailed information on the study aims can be found in Chapter 3. The two different experimental approaches (Chapter 4 & 5) used in this thesis are based on the same animal trial where different diets containing high and low amounts of ZnO on newly-weaned piglets are tested. Briefly, piglets were fed diets containing 57 (low) or 2425 (high) mg kg-1 zinc from analytical grade ZnO. For the first experiment (Chapter 4) intestinal contents from stomach, jejunum, ileum and colon were sampled from 32, 39, 46 and 53d old piglets and analyzed for bacterial cell numbers and main bacterial metabolites. The most drastic effects of high dietary zinc could be found one week after weaning in the stomach and small intestine. Cell numbers of Enterobacteriaceae, the Escherichia group as well as from Lactobacillus spp. and three abundant Lactobacillus spp. were reduced. The influence of high dietary zinc was transient for enterobacteria but permanent for Lactobacillus spp. No impact could be observed at cell numbers of bifidobacteria, enterococci, streptococci, Weissella spp. and Leuconostoc spp. as well as the Bacteroides-Prevotella-Porphyromonas group. Among the microbial metabolites molar acetate ratios increased and propionate decreased in the proximal intestine and lower lactate concentrations were observed in the high dietary zinc group throughout the feeding trial. However, the differences between the dietary groups in cell numbers and in microbial metabolites diminished in older animals. For the second experiment (Chapter 5) digesta samples from the stomach and jejunum of 32, 39, 46 and 53d old animals (n = 6 per group) were sampled and incubated for 16h under anaerobic conditions in a complex media containing 80, 40, 20 and 0 μg mL-1 soluble Zink. Specific growth rate, maximum growth and lag time were calculated according to the obtained growth curves. The highest rate of growth and lowest lag times could be observed in the samples from animals fed the low dietary zinc concentration in media without added zinc. The samples from animals fed the high dietary zinc concentration showed highest growth rates and lowest lag time in the media supplemented with zinc. Bacterial growth of digesta samples from the high dietary zinc group was less influenced by zinc and recovered growth more rapidly than in the low dietary zinc group and samples from older animals of the low dietary zinc group also showed reduced growth depression. Bacterial cell number analysis from PCR results showed that lactobacilli were reduced by the zinc treatment, while bifidobacteria and enterococci showed increased growth in samples from the high dietary zinc treatment. Enterobacteria from samples of the high dietary zinc group showed an increased growth rate at high zinc concentrations in the medium. No differences were observed for the analyzed clostridial cluster and the Bacteroides-Prevotella-Porphyromonas group. The studies have shown that the supplementation of feed with high doses of zinc leads to a reduced ex vivo - bacterial growth rate of bacteria from the stomach and jejunum and to transient and lasting effects during the development of the intestinal microbiota along the whole GIT in vivo, affecting composition as well as metabolic activity of weaned piglets. In view of the rapid bacterial adaptation to dietary zinc ex vivo as well as in vivo , the administration of ZnO as feed additive for weaned piglets might only be beneficial in a short period after weaning. In Chapter 6 the results of both experimental approaches are discussed and summarized with contributions to evaluate new feeding strategies in modern animal nutrition in respect of microbial communities in the gut.

Die Entwicklung neuer Fütterungsstrategien zum Erhalt der Darmgesundheit im Absetzferkel gewinnt im Hinblick auf die Vermeidung von Antibiotika und das damit mögliche Aufkommen antibiotikaresistenter Bakterien mehr und mehr an Bedeutung. Seit Ende der 80’er Jahre wird Zinkoxid (ZnO) in erhöhter Dosierung als Futterzusatzstoff für das Absetzferkel untersucht (Überblick in Kapitel 1). In Kapitel 2 wird eine Übersicht auf forschungsrelevante Veröffentlichungen zum Thema Darmmikrobiota – Wirtsinteraktionen und Zinkverabreichung in pharmakologischen Dosen gegeben. Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die Darmmikrobiota im Absetzferkel unter Einfluss von hochdosiertem ZnO als Nahrungszusatzstoff zu untersuchen. Im Vordergrund steht dabei der Wissenserhalt zu strukturellen und funktionellen Veränderungen von Darmbakterien um neue Fütterungsstrategien einzuschätzen beziehungsweise den Einsatz von Antibiotika als Wachstumsförderer zu vermindern. Eine detaillierte Übersicht zu diesem Thema ist in Kapitel 3 zu finden. Den beiden experimentellen Ansätzen, beschrieben in Kapitel 4 & 5, liegt ein Tierversuch, in dem zwei unterschiedliche Diäten mit jeweils hohen und niedrigen Zinkdosen an Absetzferkel verabreicht wurden. Dabei wurden Landrassenferkel jeweils 57 (niedrig) oder 2425 (hoch) mg kg-1 ZnO (p.a. Qualität) über die Dauer von 4 Wochen nach dem Absetzen verabreicht. Für den ersten experimentellen Ansatz (Kapitel 4) wurden Digestaproben aus Magen, Jejunum, Ileum und Colon jeweils von 32, 39, 46 und 53 Tage alten Ferkeln genommen. Sie wurden verwendet, um bakterielle Zellzahlen und bakterielle Metaboliten in vivo zu ermitteln. Die größten Einflüsse der Hochzinkdiät konnten bei den 32 Tage alten Ferkeln vor allem im Magen und Jejunum beobachtet werden. Die Zellzahlen der Enterobakterien, der Escherichia Gruppe sowie der Lactobacillus spp. Und von drei häufigen Spezies der Lactobacillus Gruppe wurden signifikant reduziert. In Hinblick auf die gesamte Versuchsperiode konnte festgestellt werden, dass der Einfluss von ZnO sich nachhaltig auf die meisten Lactobacillus Arten, jedoch nur sehr kurzfristig auf die Gruppe der Enterobakterien ausgewirkt hat. Keinen Einfluss schien die Verabreichung auf Bifidobakterien, Enterokokken, Streptokokken, Weissella spp. und Leuconostoc spp. Sowie auf die Bacteroides- Prevotella-Porphyromonas Gruppe genommen zu haben. Von den mikrobiellen Metaboliten stieg im proximalen Verdauungstrakt Acetat im Verhältnis gesehen an und der Anteil an Propionat wurde verringert. Geringere Laktatkonzentrationen konnten in der Hochzinkgruppe in allen Tieren festgestellt werden. Allerdings verringerten sich die Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen hinsichtlich der mikrobiellen Metaboliten mit zunehmendem Alter der Tiere. Für den zweiten experimentellen Ansatz (Kapitel 5) wurden Digestaproben aus Magen und Jejunum von 32, 39, 46 und 53 Tage alten Tieren (n = 6 pro Gruppe) genommen und unter anaeroben Bedingungen in ein Komplexmedium mit unterschiedlichen Zinkoxidkonzentrationen (80, 40, 20 und 0 μg mL-1) überführt und für 16 h inkubiert. Die spezifische Wachstumsrate, das maximale Wachstum und die Anlaufzeiten wurden anhand der erhaltenen Wachstumskurven ermittelt. Die höchsten Wachstumsraten bei niedrigster Anlaufzeit konnten in den Proben der Niedrigzinkgruppe im Medium ohne Zink beobachtet werden. Die Proben der Hochzinkgruppe zeigten die höchsten Wachstumsraten und geringsten Anlaufzeiten im Medium mit gelöstem Zink. Grundsätzlich konnte beobachtet werden, dass das bakterielle Wachstum aus Proben der Hochzinkgruppe weniger stark von ZnO beeinträchtigt war und sich schneller erholte als Proben der Niedrigzinkgruppe. Auch konnte beobachtet werden, dass in Zinkmedien die Proben von älteren Tieren eine geringere Wachstumshemmung erfuhren. Die bakterielle Zellzahlanalyse mittels qPCR und einem ausgewählten Primerset konnte zeigen, dass vor allem Laktobazillen stark durch die Zinkverabreichung verringert wurden. Bifidobakterien und Enterobakterien zeigten hingegen einen schwachen Anstieg der Zellzahlen in Proben der Hochzinkgruppe. Enterobakterien zeigten erhöhte Zellzahlen in Proben aus der Hochzinkgruppe, wenn diese im Zinkmedium inkubiert wurden. Keine Veränderungen konnten hingegen bei den untersuchten Clostridien und bei der Bacteroides-Prevotella-Porphyromonas Gruppe gefunden werden. Die Studien konnten zeigen, dass der Einsatz von hohen Zinkdosen im Futter zu einem reduzierten bakteriellen Wachstum unter ex vivo Bedingungen aus Magen- und Jejunumproben führt und darüber hinaus dauerhafte Einflussnahme auf die Struktur und Metaboliten der intestinalen Mikrobiota entlang des gesamten Verdauungstrakts nehmen kann. In Hinblick auf die starke Anpassungsfähigkeit der Mikroorganismen sowohl unter in vitro als auch unter in vivo Bedingungen auf ZnO sollte eine Verabreichung auf die ersten Wochen nach dem Absetzen der Ferkel beschränkt sein. In Kapitel 6 werden die Ergebnisse beider Versuche diskutiert und zusammengefasst. Dabei wird der Versuch unternommen, einen Beitrag zu neuen Fütterungsstrategien in Hinblick auf das Mikrobiom im gastrointestinalen Trakt zu leisten.