dc.contributor.author
Wenta, Nikola
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:19:38Z
dc.date.available
2009-04-07T09:20:23.449Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13240
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17438
dc.description.abstract
Das zentrale Ereignis in der Verarbeitung von Zytokinsignalen ist die
Phosphorylierung von STAT-Proteinen, die dadurch in DNS-bindende
Transkriptionsfaktoren umgewandelt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde
die DNS-Bindung von zwei STAT1-Varianten mit Mutationen in der DNS-Bindedomäne
untersucht. Die T327R-Mutante zeigte eine verlängerte und unspezifische DNS-
Bindung, die ihre in Vorversuchen beobachtete verlängerte Kernretention und
transkriptionelle Inaktivität vollständig erklärt. Die H406A-Mutante hingegen
war dem Wildtyp in der DNS-Bindungsspezifität sehr ähnlich. Allerdings könnte
diese Mutation die zur Dephosphorylierung benötigte antiparallele
Dimerkonformation destabilisieren und so die gesteigerte transkriptionelle
Aktivität der Mutante erklären. Aufgrund der wichtigen Rolle der
Dimerumlagerung bei der STAT-Inaktivierung wurde im zweiten Teil dieser Arbeit
der Einfluss der Tyrosin-Phosphorylierung auf die Stabilität und Konformation
von STAT1-Dimeren erstmalig untersucht. Durch analytische Ultrazentrifugation
stellte sich heraus, dass STAT1 unabhängig vom Phosphorylierungsstatus hoch-
affine Dimere identischer Stabilität (Kd ca. 50 nM) mit Halbwertszeiten von
ca. 20-50 Minuten bildet. Während das unphosphorylierte Dimer über die
N-Domänen stabilisiert wurde, interagierte das phosphorylierte STAT1 über die
SH2-Domänen. In EMSA-Experimenten wurde demonstriert, dass die Tyrosin-
Phosphorylierung nicht zur DNS-Bindung benötigt wird. Allerdings erhöhte sich
durch STAT1-Aktivierung die Menge der SH2-Domäne-vermittelten Dimere und somit
die DNS-Bindeaktivität mehr als 200-fach. Demnach koexistieren unabhängig vom
Phosphorylierungsstatus zwei Dimerkonformationen, die sich durch Dissoziation
und Reassoziation ineinander umwandeln. Zudem nehmen die N-Domänen nach
STAT1-Aktivierung eine offene Konformation ein, die durch Inter-Dimer-
Interaktionen die Tetramerisierung von STAT1 ermöglicht. Erstaunlicherweise
sind homotypische N-Domänen-Interaktionen jedoch in der STAT-Familie nicht
konserviert, da die Kd-Werte der isolierten N-Termini von STAT1, -3 und -4 um
den Faktor 1000 variierten. Meine Daten zeigen, dass STAT1 zwischen
verschiedenen Dimerkonformationen oszilliert und deren Häufigkeit durch
Tyrosin-Phosphorylierung reguliert wird. Für diesen dynamischen Prozess wird
ein auf den Resultaten dieser Arbeit basierendes Modell vorgestellt, das mit
vorliegenden Kristallstrukturen kompatibel ist und vermutlich paradigmatisch
für die STAT-Familie ist.
de
dc.description.abstract
The central event in the transduction of cytokine signals is the
phosporylation of STAT proteins which thereby convert into DNA binding
transcription factors. In the first part of this work, the DNA binding of two
STAT1 variants with mutations in the DNA binding domain was analysed. The
T327R mutant showed prolonged and unspecific DNA binding that completely
explains its prolonged nuclear retention and transcriptional inactivity as was
observed in previous experiments. The H406A mutant on the other hand was very
similar to the wildtype with respect to DNA binding specificity. However, this
mutation might destabilize the antiparallel dimer conformation, which is
required for dephosphorylation, and this might explain the increased
transcriptional activity of the mutant. Due to the important role of dimer
rearrangement for STAT inactivation, the influence of tyrosine phosphorylation
on dimer stability and conformation of STAT1 dimers was analysed in the second
part of this work for the first time. Analytical ultracentrifugation revealed
that STAT1 forms high-affinity dimers of equal stability (Kd ca. 50 nM) with
half-life times of 20-50 minutes, irrespective of the phosphorylation state.
Whereas the unphosphorylated dimer was stabilized by N-domain interactions,
the phosphorylated STAT1 interacted via its SH2 domains. EMSA experiments
demonstrated that tyrosine phosphorylation is dispensable for DNA binding.
However, STAT1 activation increased the amount of SH2 domain-mediated dimers
and thus enhanced the DNA binding activity of STAT1 more than 200-fold. Hence,
irrespective of the phosphorylation state two dimer conformations coexist that
convert into each other via dissociation and reassociation. Moreover, upon
STAT1 activation the N-domains adopt an open conformation that facilitates
tetramerization of STAT1 via inter-dimer interactions. Surprisingly, homotypic
N-domain interactions are not conserved in the STAT family, because the Kd
values of the isolated N-termini of STAT1, -3 and -4 varied by a factor of
1000. My data demonstrate that STAT1 oscillates between different dimer
conformations and tyrosine phosphorylation regulates the abundance of the
conformations. Based on the results of this work, a model for this dynamic
process is introduced that is compatible with existing crystal structures and
that may serve as a paradigm for the STAT family.
en
dc.format.extent
VII, 134 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Transkriptionsfaktor
dc.subject
transcription factor
dc.subject
Signal Transducer and Activator of Transcription
dc.subject
analytische Ultrazentrifugation
dc.subject
analytical ultracentrifugation
dc.subject
Protein-Protein-Interaktion
dc.subject
Tyrosin-Phosphorylierung
dc.subject
tyrosine phosphorylation
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie
dc.title
Einfluss der Tyrosin-Phosphorylierung auf die Selbstassoziation des
Transkriptionsfaktors STAT1
dc.contributor.contact
nikola.wenta@nottingham.ac.uk
dc.contributor.contact
nwenta@yahoo.com
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Wolfram Saenger (Freie Universität Berlin)
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Uwe Vinkemeier (University of Nottingham, UK)
dc.date.accepted
2009-02-23
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000009203-0
dc.title.translated
Influence of tyrosine phosphorylation on the self-association of the
transcription factor STAT1
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000009203
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000005334
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access