Zusammenfassung Herzkreislauferkrankungen wie z.B. hypertrophe und dilatative Kardiomyopathie oder Erkrankung der Herzkranzgefäße sind die Haupttodesursache in Industrienationen. Ihre Ursachen sind vielfältig und noch nicht im Detail verstanden, führen jedoch eventuell zu veränderten kontraktilen oder elastischen Eigenschaften des Herzens. Das Herz ist aus Kardiomyozyten aufgebaut. Sie kontrahieren durch das Energieverbrauchende aneinander entlanggleiten der Aktin- und Myosin-Filamente im Sarkomer, der kleinsten funktionsfähigen Einheit im Muskel. Die elastischen Eigenschaften des Sarkomers basieren auf Titin, das mit ca. 3 MDa das größte bekannte Protein ist und das halbe Sarkomer durchspannt, indem es an Z-Scheibe und M-Bande überlappt. Hierdurch bildet es ein kontinuierliches Filamentsystem. Durch seinen molekularen Aufbau aus steifen und elastischen Domänen ist Titin in der Lage, sowohl Stützfunktionen, als auch elastische Funktionen zu übernehmen. Durch seine Lage im Sarkomer, sowie dem Vorhandensein von elastischen und Signal-Domänen wurde Titin eine Rolle in der längen abhängigen Kontraktion des Herzens (Frank-Starling-Mechanismus) und der Umwandlung mechanischer Dehnung in biochemische Signale zugeschrieben. Um den Einfluss Titins auf die mechanischen Eigenschaften des Sarkomers und damit auf die Herzfunktion in vivo zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Titin-Knockout- Modelle generiert. Dazu wurden zwei Federelemente deletiert: die herzspezifische N2B-Region und die PEVK Region. Zusätzlich zu den elastischen Eigenschaften kann die N2B Region, über FHL2 auch Hypertrophie- Signaltransduktion beeinflussen, während die PEVK-Region durch die Interaktion mit Aktin als molekulare Bremse dient. In beiden Knockouts ist die Embryonalentwicklung normal, was nahe legt, dass die elastischen Domänen nicht die Sarkomerogenese beeinflussen. Anatomisch sind die Knockout Herzen normal, bis auf eine verringerte Herzgröße im N2B Knockout, die mit einer veränderten Hypertrophie-Signaltransduktion einhergeht (reduzierte FHL2 Proteinmenge und erhöhter ANP Spiegel). Die Herzstruktur bis hinunter zur Ebene des Sarkomers ist im N2B Knockout unverändert, abgesehen von der geringeren Ruhelänge des Sarkomers in isolierten Muskelfasern des Knockouts. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, dass die PEVK-Region und die Immunglobulindomänen nach Verlust der N2B-Region kompensatorisch gedehnt werden. Die Steifheit der N2B defizienten Muskelfasern wird dabei jedoch erhöht. Damit bestimmt Titins N2B- Region die Ruhelänge und mechanischen Eigenschaften des Sarkomers. Die erhöhte Steifheit der Muskelzellen und letztendlich des Ventrikels wird teilweise durch erhöhte Expression der schlafferen N2BA Isoform ausgeglichen. Trotzdem resultiert aus der N2B Deletion eine diastolische Fehlfunktion, die durch echokardiographische Analyse dokumentiert wurde. Der kleinere, steifere Ventrikel erreicht durch erhöhte Kontraktion das Pumpvolumen des Wildtyps. Die systolische Funktion des N2B defizienten Ventrikels ist im isoliert arbeitenden Herzen unverändert. Somit hat die Deletion der N2B-Region keinen Einfluss auf die Dehnungsabhängige Pumpfunktion des Herzens (Frank-Starling Mechanismus). Der PEVK Knockout zeigt ebenfalls eine diastolische Fehlfunktion in der Echokardiographie, die jedoch durch eine erhöhte Pulsfrequenz kompensiert wird. Die isolierten Kardiomyozyten von N2B und PEVK Knockout zeigen unterschiedliche kontraktile Eigenschaften. Während die Zellen des PEVK Knockouts eine gesteigerte Kontraktilität besitzen, ist sie in homozygot N2B defizienten Kardiomyozyten reduziert, möglicherweise über FHL2 und dessen Einfluss auf den Sarkomer-Stoffwechsel. Nach Deletion der N2B oder PEVK-Region ist die Lokalisierung der jeweiligen Bindungspartner unverändert. Die FHL2-Proteinmenge unterscheidet sich jedoch abhängig von der vorliegenden Deletion. Bei Verlust der N2B-Region ist FHL2 stark reduziert, während der Verlust der PEVK-Region zur verstärkten Expression führt. Somit scheint die Regulation der Expression von FHL2, welches auch in Herzerkrankungen unterschiedlich stark exprimiert wird, von der I-Bande abhängig zu sein. Die in der vorliegenden Arbeit erzeugten Tiermodelle zeigen eine Funktion von Titin sowohl im Hypertrophie-Signalweg als auch in der elastischen Funktion des Herzens. Sie sind die ersten genetischen Modelle um die diastolische Dysfunktion zu studieren und ermöglichen es neue Ansätze zur Therapie der diastolischen Herzerkrankung zu etablieren.
Abstract Cardiac diseases such as hypertrophic or dilated cardiomyopathy and coronary artery disease are the major cause of death in developed nations. The underlying causes are complex and not understood in detail, but eventually lead to altered contractile or elastic properties of the heart. The heart consists of cardiomyocytes, which contract as a result of the energy dependent sliding of the actin and myosin filaments in the sarcomere, the smalles functional unit of muscle. The elastic properties of the sarcomere are based on titin, a giant protein with over 3 MDa that spans the half-sarcomere overlapping at the Z-disk and M-band. Thus, titin forms a continuous filament system along the myofibril. Due to its unique domain structure, titin provides support and elasticity. Based on its integration into the sarcomere and the presence of elastic and signalling domains, titin has been proposed to play a role in the length dependent contaction of the heart (Frank-Starling- Mechanism) and the conversion of mechanical stimuli into biochemical signals. To study the influence of titin on the mechanical properties of the sarcomere and cardiac function in vivo, I have generated two titin knockout models removing its elastic spring elements, the heart specific N2B domain and the PEVK-region. In addition to their elastic properties, the N2B domain is involved in hypertrophic signal transduction via FHL2, while the PEVK-Region acts as a molecular brake through interaction with actin. In both knockouts embryonic development proceeds normally, which suggests that the elastic domains do not interfere with sarcomerogenesis. Anatomically, the knockout hearts are normal, except for the reduced size of the N2B knockout heart, which is associated with altered hypertrophy signalling (reduced levels of FHL2 and increased ANP expression). Histology and ultrastructure of the N2B knockout heart are unchanged compared to littermate controls, except for the reduced slack length of the sarcomere. Electron microscopy revealed that in response to the loss of titin s N2B-Region extension of the PEVK-Region and the immunoglobulin domains is increased. This leads to an elevated stiffness of isolated muscle fibers from N2B deficient animals. Thus, titin s N2B-Region determines the slack length and the mechanical properties of the sarcomere. The increased stiffness of cardiomyocytes is partly compensated through the increased expression of the more compliant N2BA isoform. Nevertheless, the N2B deletion results in diastolic dysfunction, as documented by echocardiography. The smaller and stiffer ventricle produces a cardiac output comparable to wildtype controls by increased fractional shortening. The systolic function of the N2B deficient ventricle is not affected as show in the isolated heart setup. Thus, the deletion of the N2B-Region does not influence the length- dependent contractile force of cardiac muscle (Frank-Starling-Law). Echocardiography of the PEVK knockout reveals a trend to diastolic dysfunction compensated by an increased heart rate. Cardiomyocytes derived from N2B or PEVK knockouts display altered contracting properties. While the fractional shortening in the PEVK knockout cells increases, the contractility in the N2B knockout cardiomyocytes is reduced, possibly via FHL2 and its influence on the sarcomere metabolism. Deletion of the N2B or PEVK-Region did not change the localisation of the respective binding proteins. However, FHL2 protein levels are altered in both knockouts. FHL2 expression is decreased in the N2B knockout, but increased after deletion of the PEVK-Region. Thus, the regulation of FHL2, which is altered in heart disease, is dependent on titin s I-band. The animal models presented here demonstrate a role of titin in both hypertrophy signalling and the elastic function of the heart. They provide the first genetic model to study diastolic dysfunction and could be a valuable tool to develop novel therapeutic strategies for diastolic heart failure.
