Beschreibung der Methylierung der hypothalamus-spezifischen Enhancer des Pro- Opiomelanocortin Gens

Abstract

Die mittels QTL-Scans erfasste Assoziation zwischen Markern im Bereich des Pro-Opiomelanocortin Locus und dem Körpergewicht, ohne dass im Gen selbst gelegene, funktionell bedeutsame Polymorphismen identifiziert werden konnten, rückt die transkriptionelle Regulation dieses für die Energiehomöostase entscheidenden Gens in den Mittelpunkt. Die funktionelle Charakterisierung der hypothalamus-spezifischen Enhancerelemente des POMC Gens, nPE1 und nPE2, weist diese als für die hypothalamische transkriptionelle Regulation entscheidend aus. Da sich diese jedoch als interindividuell hochgradig konserviert erwiesen haben und zudem aus der Untersuchung der POMC Transkription in der Hypophyse hervorgehende Hinweise existieren, dass POMC für eine Regulation auf der Ebene der DNA-Methylierung zugänglich ist, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob sich die konservierten hypothalamus-spezifischen Enhancer für ein gewebs-spezifisch differentielles DNA-Methylierungsmuster empfänglich zeigen. Unter Anwendung der Bisulfitkonversionsmethode mit anschließender DNA- Sequenzierung gelang es, den DNA-Methylierungsstatus der hypothalamus- spezifischen Enhancer in mittels Lasermikrodissektion gewonnenen, immunhistochemisch identifizierten, POMC exprimierenden Arcuatusneuronen aus Kryoschnitten menschlicher Hypothalami darzustellen. Des weiteren wurden periphere humane und murine Blutzellen bezüglich ihres DNA- Methylierungsprofils untersucht. In humanen peripheren Blutzellen sowie in menschlichen, POMC exprimierenden Arcuatusneuronen erwies sich jedes einzelne CpG-Dinukleotid im Bereich der untersuchten Sequenzabschnitte als methyliert, was die Erwartungen einer tendenziellen Hypomethylierung der Enhancer in ihrem natürlichen Expressionskontext nicht bestätigt. Welche funktionelle Bedeutung diesem Befund zukommt, ist auf der Grundlage einer rein deskriptiven Darstellung nicht zu eruieren. Eine funktionelle Relevanz der nachgewiesenen Hypermethylierung, die im Zusammenhang mit Umweltfaktoren altersassoziiert entstanden sein könnte, ist durchaus vorstellbar. Der Einbezug eines Speziesvergleichs zur Maus ergab, dass murine ebenso wie humane Blutzellen eine komplette Methylierung aller CpG-Dinukleotide im Enhancerbereich nPE1 aufweisen, ein Ergebnis, das nahelegt, dass die Enhancerelemente nicht nur auf Sequenzebene, sondern auch bezüglich ihres DNA-Methylierungsmusters hochgradig phylogenetisch konserviert sind.

The association between markers surrounding the Pro-opiomelanocortin locus and body weight has been confirmed by several QTL scans. Because of the absence of functionally relevant polymorphisms in the coding sequence of the Pro- opiomelanocortin gene, these findings bring the transcriptional regulation of POMC into focus. The functional characterization of the hypothalamus-specific enhancer elements of the POMC gene, nPE1 and nPE2, showed that they play an essential role in the transcriptional control of POMC in hypothalamic neurons. As the enhancers have also been characterized as interindiviually highly conserved elements and evidence exists that POMC is accessible to transcriptional regulation based on mechanisms of DNA methylation in the pituitary and neuroendocrine tumors, we analyzed whether the evolutionarily conserved hypothalamus-specific enhancer elements were susceptible for a tissue-specific differential DNA methylation pattern. We applied the bisulfite-assisted genomic sequencing method to DNA extracted from POMC- expressing arcuate neurons that had previously been immuno-histochemically identified in kryo-conserved slices of human hypothalami. Furthermore, we analyzed human and murine peripheral blood cells to describe the DNA methylation profile of the hypothalamus-specific enhancers. In human peripheral blood cells as well as in POMC-expressing arcuate neurons, every single CpG-dinculeotide analyzed showed methylation, a finding that is in strong contrast to expectations of a less densely methylated enhancer complex in its natural context of expression. Which functional significance can be ascribed to this result is of course a question beyond the limits of a purely descpritive approach. Nevertheless, a functional relevance of the dense DNA methylation that could have arisen in association with environmental factors is by all means possible. Our findings of dense DNA methylation of the enhancer elements in the inter-species comparison between human and murine peripheral blood cells is in accordance with a potential phylogenetic conservation not only on the level of DNA sequence, but also concerning DNA methylation.