Molekulare Untersuchungen zur Charakterisierung der pro-angiogenen und hypertrophen Effekte der Wachstumsfaktor/PI3K/Akt-Signaltransduktionsachse

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Relevanz und downstream Substrate des PI3-Kinase/Akt-Signaltransduktionsweges in Endothelzellen und kardialen Myozyten sowie deren funktionelle Effekte untersucht. Sowohl für GSK3beta als auch für FOXO3a lagen bislang keine Untersuchungen in Endothelzellen, und für FOXO-Transkriptionsfaktoren keine Daten in Kardiomyozyten vor. Die Ergebnisse zeigen, dass GSK3beta in Endothelzellen in verschiedenen Kompartimenten mit unterschiedlicher funktioneller Sigifikanz nachweisbar ist. Der Wachstumsfaktor/PI3-Kinase-Akt-Signaltransduktionsweg inaktiviert GSK3beta durch Phosphorylierung am Serin-9. Hierdurch werden teilweise die pro- angiogenen Effekte von Akt über eine verbesserte Migration und eine verminderte Apoptose der Endothelzellen unabhängig von eNOS vermittelt. Desweiteren existiert ein GSK3beta/beta-Catenin/TCF/LCF- Signaltransduktionsweg, der jedoch upstream von Proteinkinase B/Akt das Gefäßwachstum über die transkriptionelle Aktivierung von VEGF-A und -C moduliert und eine bedeutende Rolle in der Angiogenese spielt. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit stellte die Aufklärung der Regulation und der funktionellen Effekte von FOXO3a in Endothelzellen dar. Wir konnten zeigen, dass FOXO3a durch den Wachstumsfaktor/PI3-Kinase/Akt-Signaltransduktionsweg in Endothelzellen reguliert wird und als ein wichtiger Modulator des zellspezifischen apoptotischen Zelltodes via Aktivierung des extrinsischen und intrinsischen Apoptoseweges fungiert, was dafür spricht, dass der Transkriptionsfaktor am vaskulären Remodeling nach Zellschädigung und in der postnatalen Angiogenese beteiligt ist. Unsere Ergebnisse konnten in nachfolgenden Studien bestätigt werden. Potente et. al zeigten, dass FOXO3a durch die Inhibition der eNOS-Expression in Endothelzellen anti-angiogen wirkt und auch die Angiogenese in vivo reguliert [131]. Desweiteren konnten wir in zusätzlichen Untersuchungen nachweisen, dass die Restenose nach vaskulärer Schädigung durch FOXO3a inhibiert wird [128]. Die Rolle von Forkhead- Transkriptionsfaktoren wurde auch in Kardiomyozyten untersucht. Wir konnten zeigen, dass sowohl FOXO1, als auch FOXO3a und FOXO4 in kardialen Myozyten der Kontrolle durch die PI3-Kinase/Akt-Signaltransduktion unterliegen. Verschiedene hypertrophe Stimuli wie Angiotensin II, IGF, Insulin, Noadrenalin und eine Druckbelastung sowie mechanische Dehnung führten zur Inaktivierung der Forkhead-Transkriptionsfaktoren. Die Überexpression von FOXO3a induzierte die Expression eines atrogenen Genprogramms. Die Ergebnisse weisen auf eine Rolle von Forkhead-Transkriptionsfaktoren beim „reversen Remodeling“, wie es beispielsweise beim mechanischen Unloading nach Implantation linksventrikulärer Assisstsysteme, nach Klappenersatz, bei der Kachexie, und Implantation biventrikulärer Schrittmachersysteme oder auch der Behandlung einer arteriellen Hypertrophie zu beobachten ist, hin. Desweiteren identifizierten sie die durch FOXO induzierte Expression von Atrogin-1 als gemeinsamen Antagonist der physiologischen und pathologischen Hypertrophie. Hier sind weitere Studien gerade auch über den Einfluss der Transkriptionsfaktoren auf das Matrixremodeling dringend geboten. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass grundsätzlich gleiche Signaltransduktionswege eine Atrophie im Skelett-und Herzmuskel induzieren [143, 168]. Letztendlich wurden die Effekte von Adiponectin, eines Adipozytokins, dessen Expression durch FOXO induziert wird, untersucht. Adiponectin bindet über seine Rezeptoren an kardiale Zellen, um über AMPK die PI3-Kinase/Akt-Signaltransduktion zu aktivieren. In einer klinischen Studie konnten wir zeigen, dass Adiponectin Akt in kardialen Myozyten aktiviert und die stressinduzierte Apoptose in diesen Zellen inhibiert (Abb. 5). Die Herunterregulation der lokalen kardialen Adiponectinexpression könnte somit ein Faktor im Fortschreiten der dilatativen Kardiomyopathie darstellen. Desweiteren konnten wir in nachfolgenden Untersuchungen nachweisen, dass Adiponectin durch die Aktivierung von PKB/Akt in Endothelzellen pro-angiogene Effekte besitzt und die Freisetzung und Differenzierung von endothelialen Progenitorzellen reguliert [162]. Aufgrund dieses Wirkungsspektrums wäre ein therapeutischer Einsatz bei der Erkrankung sinnvoll.

In this study the effects of downstream substrates of PI3K/Akt signaling in endothelial cells and cardiac myocytes were investigated. Our results indicate that one downstream target -GSK3beta- is present in different compartments with diverging functional capabilities. GSK3beta is inactivated by PI3K/Akt signaling through phosphorylation on a Serin-9 residue. This phosphorylation mediates the pro-angiogenic effects of the Akt by promoting migration and inhibiting apoptosis independent of eNOS. Moreover, a GSK3beta/beta- Catenin/TCF/LCF signal transduction pathway exists upstream of Akt that promotes angiogenesis by upregulation of VEGF-A and VEGF-D expression. Another downstream target of PI3K/Akt signaling is the forkhead transcription factor FOXO3a. We show that FOXO3a is regulated by PI3K/Akt in endothelial cells acting as important regulator of apoptotic cell death via inhibition of the intrinsic as well as the extrinsic apoptotic pathway. Those results indicate that FOOX3a may participate in angiogenesis and vascular remodelling post injury. Furthermore, effects of FOXO3a were investigated in cardiac myocytes. We demonstrate that FOXO1, FOXO3a, and FOXO4 are expressed and regulated by PI3K/Akt in cardiac myocytes. Several hypertrophic stimuli inactivate FOXO transcription factors. Overexpression of exogenous FOXO3a induced the expression of an “atrogenic” gene program. Those results indicate that FOXO3a may be involved in reverse remodelling observed in mechanical unloading after implantation of left ventricular assist devices or biventricular pacemakers. Moreover we could determine Foxo3a as antagonist of physiological and pathological hypertrophy. Finally, the effects of adiponectin, an adipocytokine regulated by FOXO3a, were investigated. Adiponectin binds to its receptors on cardiac cells to induce phosphorylation of AMPK and Akt. In a clinical study we demonstrate that adiponectin activates Akt in cardiac myocytes to prevent stress-induced apoptotic cell death. Patients with dilative cardiomyopathy showed low cardiac adiponectin expression implicating the adipocytokine in the pathogenesis of the disease. Because of the pro- survival effects of the adipocytokine in cardiac myocytes and its pro- angiogenic properties in endothelial cells and endothelial progenitors adiponectin might be a new therapeutic target in DCM.