Untersuchungen zur antimikrobiellen Resistenz und Virulenz von Enterococcus Isolaten aus Wirtschaftsgeflügel

Abstract

Enterococcus Isolate aus Wirtschaftsgeflügel wurden hinsichtlich ihrer antimikrobiellen Resistenz und ihrer Virulenzfaktoren untersucht. Außerdem erfolgte die Bestimmung der Virulenz im Embryoletalitätstest. In der vorliegenden Arbeit wurden 163 klinische Enterokokkenisolate von Broilern, Legehennen und Puten aus den Jahren 2010 und 2011 bearbeitet. Zur Speziesbestimmung wurden eine genus- und speziesspezifische Multiplex-PCR und eine 16S rDNA-Genanalyse durchgeführt. Die dominierende Spezies war E. faecalis (n=127). Enterococcus faecium (n=18), E. gallinarum (n=13) und E. hirae (n=5) wurden ebenfalls nachgewiesen. Das Resistenzverhalten aller Isolate gegenüber 24 antimikrobiellen Wirkstoffen wurde mit der Mikrodilutionsmethode bestimmt. Die Auswertung der ermittelten MHK50 und MHK90 Werte erfolgte mittels CLSI-Grenzwerten. Die Resistenzraten gegenüber Lincomycin (72%-100%) und Tetrazyklin (40-100%) waren für alle Spezies hoch. Außerdem waren die meisten E. faecalis und E. faecium Isolate resistent gegen Gentamicin (89-98%) und Erythromycin (70-89%). Es wurden keine Vancomycin- resistenten Enterokokken gefunden, und die Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin lag für E. faecalis, E. gallinarum und E. hirae bei 100%. Die MHK50 und MHK90 Werte für Beta-Laktame, Chloramphenicol und Sulfamethoxazol- Trimethoprim befanden sich im unteren Testbereich. Enterococcus faecalis Isolate von Puten zeigten die höchsten Resistenzraten für alle antimikrobiellen Wirkstoffe außer Ciprofloxacin und Sulfamethoxazol- Trimethoprim. Einundsechzig Prozent der Enterococcus Isolate waren gegen drei oder mehr Antibiotikaklassen resistent. Auch hier standen die Putenisolate mit 80% Multi-Resistenz hervor. Der häufigste Resitenzphänotyp bei den E. faecalis Isolaten von Broilern, Legehennen und Puten war Gentamicin, Lincomycin und Tetrazyklin. Achtundzwanzig ausgewählte Putenisolate (10 E. faecalis, 10 E. faecium, 8 E. gallinarum) wurden hinsichtlich fünf Virulenzfaktoren (Aggregation Substance, Cytolysin, Enterococcal Surface Protein, Gelatinase, Hyaluronidase) untersucht. Dazu erfolgte ein PCR-Nachweis der Virulenzgene asa1, cylA, cylB, cylLL, cylLS, cylM, esp, gelE und hylEfm und die Sequenzierung der nachgewiesenen Virulenzgene. Die phänotypische Ausprägung von Cytolysin, Gelatinase und Hyaluronidase wurde mit mikrobiologischen Tests untersucht. Das Gelatinase-Gen wurde bei allen drei Enterokokkenspezies, das asa1 Gen nicht bei E. gallinarum und das esp Gen nur bei E. faecium nachgewiesen. Drei E. faecalis und ein E. faecium Isolat wiesen das gesamte Cytolysin-Operon auf. Bei sechs E. faecium und zwei E. gallinarum Isolaten wurden keine Virulenzgene nachgewiesen. Sechs E. gallinarum Isolate zeigten Cytolysin-Aktivität, sieben E. faecalis Isolate verflüssigten Gelatine und sieben E. gallinarum Isolate zeigten Hyaluronidase-Aktivität. Im Embryoletalitätstest wurde anhand des Überlebensindex und der Absterberate die Virulenz der 28 Putenisolate bestimmt. Anhand des Überlebensindex wurden drei Isolate als hoch, sieben Isolate als mäßig und 18 Isolate als gering virulent eingestuft. Anhand der Absterberate wurde ein Isolat als hoch, acht Isolate als mäßig und 19 Isolate als gering virulent eingestuft.

Antimicrobial resistance and virulence traits of enterococcus isolated from poultry were determined. In addition, the virulence of the isolates was assessed using the embryolethality test. Between 2010 and 2011, 163 Enterococcus isolates were collected from broilers, layers and fattening turkeys that showed various clinical signs. Genus and species identification was determined with multiplex-PCR and gene sequencing. Most of the isolates were E. faecalis (n=127), while E. faecium (n=18), E. gallinarum (n=13), and E. hirae (n=5) were found in lower numbers. Susceptibility to 24 antimicrobial substances was tested using broth microdilution test to determine minimum inhibitory concentrations (MICs). CLSI established breakpoints as well as MIC50 and MIC90 values were applied for evaluation. Resistance rates for lincomycin (72-100%) and tetracycline (40-100%) were high for all Enterococcus species. In addition, most E. faecalis and E. faecium isolates were resistant to gentamicin (89-98%) and erythromycin (70-89%). No vancomycin resistant enterococci (VRE) were found and sensitivity to ampicillin was 100% for E. faecalis, E. gallinarum, and E. hirae. MIC50 and MIC90 values for beta-lactam antibiotics, chloramphenicol and sulfamethoxazole-trimethoprim were at the lower end of the test range. Enterococcus faecalis isolated from turkeys had thehighest rates of resistances for all antimicrobial substances except ciprofloxacin and sulfamethoxazole-trimethoprim. Sixty-one percent of Enterococcus isolates were resistant to three or more antimicrobial classes. Again, isolates from turkeys stood out with 80% multi-resistance. The most frequent resistance phenotypes of E. faecalis isolated from broilers, layers and turkeys were gentamicin, lincomycin, and tetracycline. Five virulence factors (aggregation substance, cytolysin, enterococcal surface protein, gelatinase, hyaluronidase) were determined in 28 isolates from turkeys (10 E. faecalis, 10 E. faecium, 8 E. gallinarum). First, virulence genes asa1, cylA, cylB, cylLL, cylLS, cylM, esp, gelE and hylEfm were determined with multiplex- PCR. Gene-specific amplification products were confirmed by gene sequencing. All 28 Enterococcus isolates were tested for hemolytic activity, and gelatinase and hyaluronidase production. The gelE gene was found in all Enterococcus species, asa1 was not found in E. gallinarum and esp was only found in E. faecium. Three E. faecalis and one E. faecium isolate showed the whole cytolysin operon. No virulence genes were found in six E. faecium and two E. gallinarum isolates. Six E. gallinarum isolates displayed cytolysin activity, seven E. faecalis broke down gelatine and seven E. gallinarum isolates displayed hyaluronidase activity. Virulence of the 28 isolates from turkeys was determined calculating survival index and death rate. According to survival index, three isolates were found highly virulent, seven isolates were moderately virulent and 18 isolates were less virulent. According to death rate, one isolate was found highly virulent, eight isolates were moderately virulent and 19 isolates less virulent.