A Gas-Phase Approach to Biomolecular Structure: Combining Ion Mobility-Mass Spectrometry with Spectroscopy

Abstract

The structure and function of a biological molecule is closely connected. Consequently, a detailed knowledge about molecular structure is essential to understand the biochemical processes inside of living organisms. Proteins are the molecular machines that carry out vital tasks and are, as such, an important target of research in life sciences. For the investigation of protein structures, gas-phase methods are on the rise. In contrast to the condensed phase, the gas phase offers a unique clean room environment that allows the investigation of isolated species, free from external influences. A central component of the present thesis is the development, characterization, and establishment of a new experimental setup that combines structure- sensitive gas-phase methods to facilitate in-depth structural investigations on protein ions and other biologically relevant molecules. Ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) is a method to separate and measure the overall sizes of molecular ions of identical mass-to-charge (m/z) ratios but different shape. Here, it is initially used to investigate the influence of the charges on a protein ion onto its folding and refolding in the gas phase. It is found that intramolecular charge solvation plays a crucial role in the formation of gas- phase structures. Furthermore, it is shown how selective microsolvation of charged sites can help to prevent the structural reorganization after the transfer from solution into the gas phase. IM-MS is, however, only sensitive to the overall shape of a molecular ion. The photodis- sociation of a protein ion using photons in the ultraviolet (UV) wavelength range, on the other hand, is potentially sensitive to structural details. The method recently emerged as a promising tool for protein sequencing applications because of its ability to yield statistically distributed bond cleavages over the entire amino acid sequence of a protein. In the newly fashioned instrument, it is combined with IM-MS to probe its potential for the study of higher order protein structure. The presented data suggests that UV (193 nm) photodissociation can highlight structural similarities between groups of different conformations of a single protein. With the aid of theoretical model structures, it is shown that the here observed similarities may be attributed to cis/trans isomerization of a single peptide bond. A method that can provide more direct information about molecular structure is infrared (IR) spectroscopy. In the IR wavelength range, absorption bands in an experimentally obtained spectrum are highly indicative for specific molecular vibrations. These, in turn, strongly depend on the local structure around the respective oscillators. A large body of experimental and theoretical work established IR spectroscopic techniques for the study of gas-phase molecular ions. The combination of IR spectroscopy with IM-MS to allow the spectroscopic investigation of m/z and shape-selected molecular ions is the main objective of the here presented experimental setup. In an initial study, it is shown how the combined methods can, in conjunction with quantum chemical calculations, unambiguously identify two different protomeric forms of the relatively small molecule benzocaine. The calculations furthermore highlight how the dielectric properties of the molecule’s environment can drastically influence the structural preferences. The applicability of this gas-phase approach to larger molecules and molecular assemblies is illustrated in the last chapter of this thesis. Here, the structures of early oligomers of short, amyloidogenic peptide sequences were investigated. Amyloidogenic peptides and proteins play a crucial role in a variety of neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. In the disease case, the involved proteins undergo a spontaneous transition from a soluble, often partially folded form into insoluble, β-sheet rich amyloid fibrils. The m/z and shape selective IR spectroscopic data presented here suggests that already early oligomeric species with as little as four or five peptide subunits can contain a significant amount of β-sheet structure. This study represents the first direct secondary structure analysis of individual amyloid intermediates and opens new possibilities for the field of amyloid research.

Die Struktur und Funktion von Biomolekülen sind eng miteinander verbunden. Um biochemische Prozesse in lebenden Organismen auf molekularer Ebene zu verstehen, ist daher die Kenntnis von strukturellen Details der beteiligten Moleküle von großer Bedeutung. Proteine sind molekulare Maschinen, die lebenswichtige Aufgaben im Organismus erfüllen, und sind als solche eines der wichtigsten Forschungsobjekte in den Lebenswissenschaften. Für Strukturuntersuchungen von Proteinen bieten Gasphasenmethoden vielversprechende Ansätze. Im Gegensatz zu Methoden die auf Untersuchungen in der Flüssig- oder Festphase basieren, bietet die Gasphase eine einzigartige Reinraumumgebung, die es erlaubt den Analyten isoliert, und frei von Umgebungseinflüssen zu untersuchen. Ein zentraler Bestandteil der vorliegenden Dissertation ist die Beschreibung, die Charakterisierung und Etablierung eines neuen Versuchsaufbaus in dem verschiedene struktursensible Gasphasenmethoden vereint sind. Durch diesen soll eine detaillierte Untersuchung von Strukturen biologisch relevanter Moleküle ermöglicht werden. Die Ionenmobilitäts- Massenspektrometrie (IM-MS) erlaubt sowohl die Trennung als auch die Bestimmung der Größe von Molekülionen mit gleichem Masse-zu-Ladungs Verhältnis (m/z), und unterschiedlicher Form. In der vorliegenden Arbeit wird sie zunächst verwendet um den Einfluss der Ladungen eines Proteinions auf dessen Faltung in der Gasphase zu untersuchen. Die Studie zeigt, dass intramolekulare Ladungssolvatation eine wichtige Rolle bei der (Um)Faltung von Proteinen in der Gasphase spielt. Darüber hinaus wird gezeigt wie selektive Mikrosolvatisierung von geladenen Gruppen dazu beitragen kann die Umfaltung potentiell nativer Strukturelemente nach dem Transfer des Proteins in die Gasphase zu verhindern. IM-MS ist jedoch nur empfindlich auf die äußere Form eines Molekülions. Die Photodissoziation von Proteinionen mittels Photonen im ultravioletten (UV) Wellenlängenbereich hingegen, ist potentiell empfindlich auf Details von Proteinstrukturen. Sie ist ein vielversprechendes Werkzeug zur Sequenzierung von Proteinen, da die Dissoziation des Proteinrückgrates statistisch über die gesamte Proteinsequenz erfolgt. In dem hier beschriebenen neuen Versuchsaufbau wird diese Methode mit IM-MS kombiniert um deren Empfindlichkeit auf höhere Proteinstrukturelemente zu untersuchen. Die präsentierte Studie zeigt, dass UV (193 nm) Photodissoziation strukturelle Ähnlichkeiten zwischen Gruppen verschiedener Proteinkonformere auflösen kann. Des Weiteren wird durch den Vergleich mit theoretischen Modellstrukturen deutlich, dass die hier beobachteten Strukturunterschiede auf die cis/trans Isomerisierung einer einzigen Peptidbindung zurückzuführen sind. Eine Methode, die sehr direkte Information über Molekülstruktur liefern kann, ist die Infrarot-(IR) Spektroskopie. Absorptionsbanden in einem experimentellen Infrarot-Molekülspektrum sind höchst indikativ für bestimmte Vibrationen innerhalb eines Moleküls. Diese wiederum sind stark von der lokalen Struktur der jeweiligen Oszillatoren abhängig. Eine große Anzahl experimenteller und theoretischer Studien haben die Methode auch für die Untersuchung von Gasphasenmolekülen etabliert. Die Kombination von IR-Spektroskopie mit IM-MS zur spektroskopischen Untersuchung von größen- und m/z-selektierten Molekülionen ist einer der Schwerpunkte dieser Dissertation. Es wird zunächst gezeigt, dass die kombinierten Methoden, in Verbindung mit quantenchemischen Rechnungen, eindeutige Indizien für zwei verschiedene Protomere des relativ kleinen Moleküls Benzocain liefern kann. Die Rechnungen zeigen zudem, dass die dielektrischen Eigenschaften der direkten Molekülumgebung großen Einfluss auf die Stabilität bestimmter Strukturen haben können. Dass der kombinierte Gasphasenansatz auch auf größere Moleküle und Molekülaggregate anwendbar ist, wird im letzten Kapitel dieser Arbeit gezeigt. Hier werden die Strukturen von frühen Oligomeren kurzer, amyloidogener Peptidsequenzen untersucht. Solche amyloidogene Peptide und Proteine spielen eine zentrale Rolle in einer Vielzahl neurodegenerativer Krankheiten wie Alzheimer oder Parkinson. Im Krankheitsfall gehen die involvierten Proteine spontan von einer löslichen, teilweise gefalteten Form zu unlöslichen Fibrillen über, die reich an β -Faltblatt-Sekundärstrukturelementen sind. Größen- und m/z-selektive IR- Spektroskopie bietet hier erste Anhaltspunkte, dass schon frühe Oligomere mit nur vier oder fünf Peptid- Untereinheiten einen erheblichen Anteil an β-Faltblättern besitzen können. Diese Studie stellt die erste direkte Messung von Sekundärstruktur von isolierten Amyloid-Intermediaten dar, und eröffnet somit neue Wege auf dem Feld der Amyloidforschung.