HINTERGRUND: Noch immer stellt die Primärinfektion bzw. die Reaktivierung des humanen Cytomegalievirus (HCMV) bei Immunkompromitierten ein großes klinisches Problem dar. Die T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Infektion. Die Untersuchung der T-Zell-Antwort ist daher von größter Wichtigkeit. Peptide zur Stimulation von T-Zellen können hierbei hilfreich sein. Wie Peptide und Peptidpools in Abhängigkeit von ihrem Einsatzziel optimal konfiguriert sein sollten, steht bisher nicht abschließend fest. In dieser Arbeit sollte daher geklärt werden, wie die Peptide und Peptidpools konfiguriert sein müssen, um möglichst optimal spezifische T-Zell- Antworten zu erfassen. Stellvertretend wurden dazu Peptide der Proteine pp65 und IE1 aus HCMV gewählt. Es sollte geklärt werden, ob unterschiedliche Anforderungen an die eingesetzten Peptide gestellt werde, wenn CD4 und CD8 T-Zellen simultan durchgeführt werden und welchen Einfluss das Epitop flankierende Aminosäuren auf die Stimulationseffizienz des Peptides haben. Es sollte zudem geklärt werden, ob eine pp65-Gesamtmischung aus mit dem Verfahren der Spotsynthese hergestellten 9-AS-Peptiden realisierbar ist, die in ihrer Fähigkeit CD8 T-Zellen zu stimulieren mit einer Mischung aus 15-AS-Peptiden vergleichbar ist. METHODEN: Dazu wurden 15-AS-Peptide und 9- bzw. 10-AS- Peptide eingesetzt zur Stimulation von PBMC von insgesamt 11 Spendern mit bekannten Reaktivitäten gegenüber Epitopen aus den Virusproteinen pp65 und IE1. Teilweise wurden die Peptide mittels Festphasen-Peptid-Synthese eigenständig synthetisiert. Die resultierenden T-Zell-Reaktionen wurden durch Färbung von intrazellulärem Interferon-gamma durchflusszytometrisch sichtbar gemacht. ERGEBNISSE: Kurze Peptide stimulieren CD8 T-Zellen effektiver als korrespondierende längere 15-AS-Peptide. Eine pp65-Gesamtmischung schien sinnvoll, die aus kurzen überlappenden 9-AS-Peptiden bestand. Diese Mischung erzielte vergleichbare Ergebnisse wie die konventionelle aus 15-AS-Peptiden bestehende. Wir verlängerten definierte kurze Peptide um einzelne AS sowohl C- als auch N-terminal. Die Addition von AS hatte sehr unterschiedliche Auswirkungen auf die Stimulationseffektivität in Abhängigkeit von der angehängten AS, ob diese C- oder N-terminal angehängt wurde und dem Individuum mit seiner eigenen Ausstattung an HLA-Molekülen, Peptidasen sowie anderen noch nicht bekannten Faktoren. Zum Screening von CD4 T-Zell-Antworten sind Pools mit 15-AS-Peptide und 12 Überlappungen mindestens so effizient wie die entsprechenden rekombinanten Proteine. Falls kürzere Peptide verwendet werden, könnten einige CD4-Antworten verloren gehen. Es wurde gezeigt, dass auch 9-AS- Peptide CD4 T-Zellen stimulieren können. Epitop-flankierende AS können aber eine wichtige Rolle bei der CD4 T-Zell-Stimulation spielen, da der TCR auch AS außerhalb der MHC-Bindungssequenz erkennen kann. SCHLUSSFOLGERUNGEN: Bei der Untersuchung von CD8 T-Zell-Antworten empfehlen wir zum Screening oder als Verlaufskontrolle 15-AS-Peptid-Pools. Zur Quantifizierung halten wir kurze Peptide für überlegen. Sollen sowohl CD4 als auch CD8 T-Zell-Antworten untersucht werden, können 15-AS-Peptid-Pools verwendet werden. Eine interessante Alternative dazu stellt die Kombination aus kurzen und langen Peptiden dar.
BACKGROUND: Human Cytomegalovirus (HCMV) primary infection as well as reactivation is still a severe clinical problem for immunodeficient patients. T-cell mediated immunity plays an important role in controlling the disease. Therefore the investigation of the cellular immunity is fundamental. While peptides and peptide pools for stimulation of T-cells are a helpful tool, it still is not known how they should be configured for best results. The aim of this work is to define peptides and peptide pools to detect specific T-cell answers. Therefore peptides out of the virus proteins pp65 and IE1 were chosen. It is important to clarify whether the peptides should meet different demands for simultaneous investigations of CD4 and CD8 T-cells and in which way epitope flanking amino acids affect the efficiency of the peptides. In addition we clarified whether a pp65 mixture composed of 9mers is feasible and if its stimulative abilities are comparable to a mixture of 15mers. METHODS: 15mers and 9mers, or 10mers respectively, were used for the stimulation of PBMC of 11 donors with a known reactivity towards epitopes out of the virus proteins pp65 and IE1. In part, the peptides have been synthesized independently with a Solid Phase Peptide Synthesis. The resulting T-cell responses were identified by flow cytometric detection of intracellular interferon gamma. RESULTS: Short peptides stimulate CD8 T-cells more effeciently than corresponding longer ones. A pp65 peptide pool containing overlapping 9mers was as effective as the established pp65 peptide pool made of 15mers. We extended defined short peptides by adding single amino acids at the C- as well as at the N-terminus. The addition of the amino acids had disparate impact on the efficacy of T-cell stimulation depending on the added amino acid, whether it was attached C- or N-terminal and on the individual equipment of HLA molecules, peptidases and other not yet known factors. For screening of CD4 T-cell responses pools with 15mers and 12 overlapping amino acids are at least equally effective as recombinant proteins. If shorter peptides are used, some CD4 T-cell responses may be lost. Epitope flanking amino acids may play an important role in stimulating CD4 T-cells because the TCR is able to identify amino acids beyond the MHC binding sequence. Additionally 9mers showed that they are in principle able to stimulate CD4 T-cells. CONCLUSION: For investigating CD8 T-cell responses we recommend pools with 15mers for screening or course observation. For quantification of the CD8 T-cell response short peptides are superior. For investigating CD4 and CD8 T-cell responses, pools with 15mers are a possible choice. An alternative would be the combination of short and long peptides.
