Kombinationstherapie von Anti-Tumor-Toxinen und Reinsaponinen am Maus- Tumormodell

Abstract

Seit mehreren Jahren spielen bei der Behandlung von Krebserkrankungen neue Medikamente eine wachsende Rolle. Dabei handelt es sich um Toxine, die zielgerichtet gegen Merkmale, die ausschließlich verstärkt bei Tumorzellen vorkommen, wirken. Zwar schädigt auch die klassische Chemotherapie Tumoren stärker als gesundes Gewebe, jedoch treten oft schwerwiegende Nebenwirkungen auf. Bei den tumorspezifischen Merkmalen, an die die neuen Substanzen binden, handelt es sich insbesondere um den humanen epidermalen Wachstumsfaktor- Rezeptor. Die verstärkte Expression dieser Rezeptoren auf Tumorzellen führt dazu, dass sich die Zellen unkontrolliert vermehren. Bindet aber ein Toxin gezielt an die Rezeptoren und veranlasst die Apoptose der Krebszelle, kann das Tumorwachstum unterbunden werden. Fusioniert man die Ribosomen inaktivierenden Proteine (RIP’s) Dianthin und Saporin mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) entstehen die zielgerichteten Toxine SE und DE. Die Freisetzung der internalisierten RIP’s ins Cytosol (Endosomal Escape) kann durch die gleichzeitige Anwesenheit von triterpenoiden Saponinen (SO1861, GS16 und SA1641) unterstützt werden. Dadurch lässt sich eine Toxizitätssteigerung bei gleichzeitiger Dosisreduzierung des RIP’s erreichen. Zunächst wurde für diese Forschungsarbeit eine nähere Charakterisierung von DE und SE durchgeführt. Die Ausbeute der beiden RIP’s nach identischer Expression erwies sich bei DE deutlich als höher als bei SE (0,375 mg/ml im Vergleich zu 0,15–0,225 mg/ml). Darüber hinaus zeigte sich DE bei einer Exposition von 30 min bei 24°C deutlich stabiler. Der Vergleich der enzymatischen Aktivität von DE und SE ergab eine höhere NGlykosidase Aktivität von DE gegenüber SE (115,7 zu 79,9 pmol Adenin/pmol Toxin/h). Untersuchungen der beiden RIP’s im Zirkulardichroismus-Spektrometer bestätigten die bereits bekannte, große Homologie der beiden Toxine, denn die Graphen dieser Untersuchungsmethode wiesen auch nach Zugabe von Saponin (SO1861) in gleichmolarer Konzentration (11,3 nM) enorme Ähnlichkeit auf. Die Untersuchung der Schmelzpunkte beider RIP’s zeigte einen Unterschied von nur 1°C. Im Rahmen der späteren Anwendung unterschiedlicher Ziellinien am Tier wurde auch die Expression des humanen EGFRezeptors (EGFR) auf der Oberfläche der Tumorzelllinien überprüft, welche für die Tierexperimente vorgesehen waren. Alle verwendeten Zelllinien zeigten im Westernblot EGFR-positive Banden. Auch nach Anwendung der Ziellinien am Tier konnte eine immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes weiterhin das Vorhandensein von EGFR durch massive Braunfärbung nachweisen. Auf die Charakterisierung der RIP’S und den Nachweis von EGFR auf den Zielzellen folgte die genauere Analyse der Saponine. Die Untersuchung der prozentualen hämolytischen Aktivität ergab, dass alle drei ausgewählten Saponine (SO1861, GS16 und SA1641) bis zu einer Konzentration von 15,65 μg/ml, die deutlich oberhalb der Konzentration liegt, die für den Einsatz am Tier angewendet wurde, nicht hämolytisch wirkten. Auch in den mit DE kombinierten Untersuchungen zeigte sich keine Zunahme der hämolytischen Aktivität. Hervorzuheben ist, dass das Saponin SO1861 im Vergleich die am wenigsten toxischen Eigenschaften aufwies. Diese Beobachtung konnte auch bei den in- vitro-Untersuchungen mittels impedanzbasierter Echtzeit-Messungen (xCelligence-Gerät) bestätigt werden. Weitere in-vitro-Experimente wurden durchgeführt, bei denen die toxische Wirkung der RIP’s in Kombination mit der effektsteigernden Wirkung der Saponine ebenfalls durch impedanzbasierte Echtzeit-Messungen und den Einsatz eines Endpunkt-Zytotoxizitätsassays (MTT) getestet wurde. Im MTT-Assay lag die IC50 der Zellen die mit SE allein behandelt wurden bei einer Konzentration von 10 nM, bei SE in Kombination mit Saponin (GS16) hingegen bei 0,0001 nM. Bei den Echtzeit-Messungen zeigte sich, neben ähnlich stark ausgeprägter Effektivität der Kombination aus RIP’s und Saponinen, darüber hinaus eine hohe Rezeptorspezifität. Die kombinierte Applikation von DE und SE mit unterschiedlichen Reinsaponinen wurde ferner in vivo in syngenen Mausmodellen untersucht. Nach Injektion der Tumorzellen (z. B. 1,25 × 105 TSA-EGFR Zellen) und erfolgter Therapie (z. B. 15 μg/Injektion GS16 in Kombination mit 0,3 μg/Injektion SE, 30 μg/Injektion GS16 in Kombination mit 0,1 μg/Injektion von SE, insgesamt 28 Tage, 8 Dosen) konnte ein massiver Tumorrückgang über 95 % (p < 0.05) bei den behandelten Tieren nachgewiesen werden. Erstmalig wurde ein ähnlich konzipiertes Experiment erfolgreich an Nacktmäusen mit humanen Kolonkarzinomzellen (2 × 106 Zellen, HCT116) durchgeführt. Die Tumorregression betrug hierbei für die therapierten Tiere 96 % (p < 0.05). Nach Abschluss der Therapien wurden die entnommenen Organe histologisch begutachtet, um den Zustand der eventuell durch Nebenwirkungen beeinträchtigten Organe zu erfassen und den Erfolg der Kombinationstherapie zu untermauern. Bei den unbehandelten Tieren im disseminierten Tumormodell konnten in 75% der Fälle neben dem Primätumor auch Lungenmetastasen nachgewiesen werden. Die Resultate dieser Arbeit können als eine gute Basis für die Weiterentwicklung bestehender Kolonkarzinomtherapien dienen und den Grundstein für präklinische Studien mit dieser Art der zielgerichteten, saponingestützten Tumorbehandlung setzen.

Since several years new strategies in the field of cancer therapies are getting more and more important. Especially targeted toxins are able to eliminate tumor cells by receptor specific binding. The classical chemotherapy is also more harmful for tumor tissues than for normal cells but still causes many severe side effects. The new therapeutic toxins are binding to tumor specific surface molecules such as the epidermal growth factor receptor (EGFR), which is highly overexpressed on a number of tumors. The binding subsequently leads to apoptosis of the tumor cells and inhibits the tumor growth. When ribosomeinactivating proteins (RIP’s) such as Dianthin or Saporin get merged with the epidermal growth factor, the fusion proteins DE and SE are formed. The release of the internalized RIP’s can be enhanced by the presence of triterpenoid saponins (SO1861, GS16 and SA1641). Therefore the efficacy of the toxic effect can be increased while the dose can be reduced. The first step of this work was to closer characterize DE ad SE. The yield of both RIP’s after identical expression was impressively higher in the case of DE compared to SE (0,375 mg/ml compared to 0,15–0,225 mg/ml). In addition DE showed a greater stability after exposure for 30 min at 24°C. Comparison of the enzymatic activity demonstrated a higher N-Glycosidase activity of DE towards SE (115,7 towards 79,9 pmol Adenin/pmol toxin/h). The investigations of both RIP’s in a circular dichroism spectrometer approved the already known, high homology of both toxins. Both graphs were extremely similar even after adding an equal molar concentration (11,3 nM) of SO1861. The screening of the melting points of both RIP’s showed a difference of only 1°C. In order to use different cell lines in animals, the expression of EGFR was examined and EGFR- positive bands were detected in Western Blot analysis. Furthermore, after injecting the cell lines into the animals, the immunhistochemical staining revealed a brown color, which indicates the presence of the receptor. After characterization of DE and SE and the proof of EGFR expression by the targeted cell lines a more exact analysis of the saponins was conducted. The examination of the hemolytic activity of the three tested saponins revealed that no hemolytic activity appears up to a concentration of 15,65 μg/ml. This concentration was far below the one, which was planed to be used for the animal experiments. The application of DE did not affect the hemolytic experiments negatively. It should be emphasized that SO1861 in comparison to the other saponins had shown the lowest toxicity. This observation was confirmed in the in vitro examinations with a real-time impedancebased device (xCelligence reader). Further in vitro experiments have been performed, in which the toxic effect of the RIP’s was tested together with the effect enhancing qualities of the saponins. This was not only conducted with the xCelligence reader but also with an endpoint cytotoxicity assay (MTT). In case of the MTT assay the IC50 of the cells that were treated only with SE was at a concentration of 10 nM whereas in combination with GS16 the concentration was 0,0001 nM. These strong enhancing effects of the saponins were also ascertained in the xCelligence reader and high receptor specificity was visible. The combined application of DE and SE was further investigated in vivo in syngeneic mouse models. After the injection of the tumor cells (1,25 × 105 TSA-EGFR cells) and the therapy (15 μg/injection GS16 in combination with 0,3 μg/injection SE or 30 μg/injection GS16 in combination with 0,1 μg/injection SE, in total 28 days, 8 doses) a regression of over 99 % (p < 0.05) was determined in the treated animals. For the first time a similar tumor model was successfully established and treated in athymic nude mice bearing a tumor of human colon carcinoma cells (2 × 106 cells, HCT116). In this case the regression of the tumor was 96 % (p < 0.05) for the treated animals. After finishing the therapies histological parameters were obtained in order to gather the side effects in the different organs. In case of the untreated animals of the disseminated tumor model lung metastasis was found in 75% of the cases apart from the primary tumor. The results of this work can be regarded as a strong basis for further developments of already existing colon cancer therapies and serve as a foundation stone for preclinical studies with this kind of targeted, saponin-enhanced tumor treatments.