Bedeutung spaltbarer Peptidlinker für die Funktion rekombinanter Saporin-EGF- Immunotoxine

Abstract

Bei der Behandlung von Krebserkrankungen gewinnen immuntherapeutische Verfahren aufgrund der schwerwiegenden Nebenwirkungen herkömmlicher Zytostatika zunehmend an Bedeutung. Immunotoxine, die sich aus einem tumorspezifischen Antikörper, Antikörperfragment oder Liganden und einer hochaktiven, toxischen Domäne eines Proteintoxins zusammensetzen, stellen innerhalb einer solchen Therapie ein vielversprechendes Konzept dar. Der Therapieerfolg wird hierbei hauptsächlich durch (a) die Selektivität des zielzellspezifischen Liganden, (b) die Effektivität der cytosolischen Aufnahme, (c) die cytotoxische Aktivität des Proteintoxins, (d) die Immunogenität sowie (e) die von der Größe des Immunotoxins abhängige effektive Tumorpenetration und (f) die Stabilität des Immunotoxins bestimmt. Zur Optimierung der Immunotoxine wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein universeller, molekularbiologisch hergestellter Adapter entwickelt, der zu einer effizienten Akkumulation des Proteintoxins im Cytosol der Zielzellen führt und zudem unerwünschte Nebenwirkungen verhindern soll, die bislang aufgrund von hoher Stabilität herkömmlicher Linker in Immunotoxinen auftreten. Dieser Adapter besteht aus einem Membrantransferpeptid, das N-terminal von einer cytosolisch und C-terminal von einer endosomal spaltbaren Sequenz flankiert wird und das Toxin mit dem Liganden verbindet. Als tumorspezifischer Ligand wurde der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), als Proteintoxin das ribosomeninaktivierende Protein Saporin verwendet. Nach erfolgreicher rekombinanter Darstellung des Saporins gelang es, zur Bestimmung seiner enzymatischen Aktivität einen neuartigen, nichtradioaktiven Multienzymassay zu entwickeln. Mit diesem Assay kann die N-Glycosidaseaktivität, auf der die toxische Wirkung des Proteins beruht, anhand des spezifisch freigesetzten Adenins aus einem DNA-Substrat quantifiziert werden. Als endosomal spaltbare Sequenzen dienten die natürlichen und eine mutierte Spaltstelle aus Pseudomonas Exotoxin und Diphtheriatoxin. Die cytosolisch spaltbaren Sequenzen bestanden aus einem in Hefezellen spaltbaren Tripeptid sowie den Erkennungssequenzen von Caspase-1, Caspase-3 und Procaspase-3. In dieser Arbeit konnte die Funktionalität des Adapters in in vitro-Versuchen nachgewiesen und durch Modifikation das Verhalten der spaltbaren Sequenzen in Bezug auf ihre Plasmastabilität optimiert werden. Nach der erfolgreichen Darstellung verschiedener Immunotoxinkonstrukte mit und ohne Adapter wurden mittels eines auf der Umsetzung von Fluoresceindiacetat basierten Cytotoxizitätsassays an verschiedenen Zelllinien IC50-Werte ermittelt. Es zeigte sich für diese Immunotoxine erwartungsgemäß neben einer beeindruckenden Zielzellspezifität auch eine ausgeprägte hohe cytotoxische Aktivität. Um die Auswirkung des Adapters auf Nebenwirkungen für normal differenzierte Zellen zu untersuchen, wurde durch Zellkulturtechniken eine tumorähnliche Umgebung simuliert, bei der die Auswirkung der zielzellspezifischen Spaltung und Akkumulation des Immunotoxins auf andere Zellen untersucht wurde. Die hieraus gewonnenen Daten belegen anschaulich, dass der Adapter das Potential der Nebenwirkungen von Immunotoxinen reduziert. Weiterführende Arbeiten zeigten, dass bei der Verwendung anderer Toxine und Liganden eine optimale Anpassung des Adapters an die jeweiligen Anforderungen erforderlich ist. Durch den auf molekularbiologischer Ebene gezielt modular gestalteten Aufbau des Adapters lassen sich jedoch seine funktionellen Bereiche problemlos austauschen, so dass sich hier die einmalige Möglichkeit bietet, Immunotoxine den notwendigen Bedingungen einer Krebstherapie in einfacher Weise anzupassen.

Over the last few years there has been an increased interest in Immune- therapeutic procedures for the treatment of cancer due to the serious side effects of conventional cytostatic drugs. Immunotoxins, which consist of a tumor-specific antibody, antibody fragment or ligand and a highly activ toxic domain of a protein toxins, represent a promising concept for such a therapy. Therapy success is determined mainly by (A) the selectivity of the cell- specific ligand, (B) the effectiveness of the cytosolic uptake, (C) the cytotoxic activity of the toxin, (D) the immunogenecity as well as (E) effective tumor penetration dependent on immunotoxin size and (f) the stability of the Immunotoxins. In this work a universal molecular adapter was constructed for optimizing immunotoxins with respect to an efficient accumulation of the toxin in the cytosol of the cells to prevent undesirable side effects, due to the high stability of conventional immunotoxins. The adapter consists of a membrane-transfer-peptide flanked N-terminal by a cytosolic and C-terminal by a endosomal cleavable sequence and connects the toxin with the ligand. As tumor-specific ligand epidermal growth factor (EGF) and as toxin ribosomeinactivating protein saporin were use. A multienzyme assay was developed to determine the enzymatic activity of the recombinant saporin. The N-glycosidaseactivity, the mechanism of action of saporin, can be quantified on the basis the specifically set free adenine from a DNA substrate. The endosomal cleavable peptide contains the natural and a mutated sequence from Pseudomonasexotoxin and Diphtheria toxin, respectivly. The cytosolisch cleavable peptide consists of three recognitionsequences for Caspase-1, Caspase-3, Procaspase-3 and a protease from yeast. In this work the functionality of the adapter in vitro could be proven and optimized by modification regarding its plasma stability. After the successful construction and purification serveral immunotoxins with and without adapter the IC50 values were determine on different cell lines using a assay wich convert fluoresceindiacetate to fluorescein. The immunotoxins exhibited ligand specificity and are highly cytotoxic with IC-50 value of ?2 nM. To examine the effect of the adapter on reducing side effects for normal differentiated cells, a tumor-similar environment was simulated. The effect of cell-specific inactivation and accumulation of the immunotoxins were examined. The data suggest that the adapter reduces the potential of the side effects for the immunotoxins. Further researche in the laboratory showed that use of other toxins and ligands requires modifications within the adapter for optimal activity. Due to the modular structure of the adapter on a molecular level the functional domains can be easely exchanged thus the adapter offers an unique possibility of optimising Immunotoxine for a specific cancer therapy in simple manner.