Das Humangenomprojekt lieferte der Menschheit vor etwas mehr als zehn Jahren die Entschlüsselung ihres eigenen Erbguts. Um aus dem neugewonnenen Wissen Rückschlüsse ziehen zu können, bedarf es neben einer kontinuierlichen Erforschung der entdeckten Gene auch eines Verständnisses der Flut an Wechselwirkungen, die diesen Mikrokosmos regulieren. Einsicht in die Wechselwirkungen bereitet den Boden für eine Fülle an Anwendungen in der Humanmedizin und darüber hinaus. In vorliegender Arbeit wurde das Gen PITX1 untersucht, welches für die korrekte Entwicklung der hinteren Extremität verantwortlich ist. Wird es in dieser Funktion gestört und z.B. in der vorderen Extremität unerwartet hochreguliert, entwickelt sich eine als homeotische Tranformation bekannte Störung, die als Liebenberg-Syndrom bekannt ist1. Die entstehende vordere Extremität ähnelt dabei dem Aussehen nach einem Arm, entwickelt aber morphologische Charakteristika der hinteren Extremität2. In dieser Arbeit wurden neun potentiell regulatorische Abschnitte (Enhancer) aus dem Genom um PITX1 ausgewählt. Sie wurden mithilfe eines LacZ- Reporterkonstrukts auf ihre Funktion in vivo hin untersucht. Dazu wurden sie über verschiedene Klonierungsschritte und Transfektion in embryonale Stammzellen eingebracht, die in Mäuse verpflanzt wurden. Die resultierenden Embryonen wurden vor Austragung entnommen und an Tag E11.5 mit einer Lösung behandelt, die bei erfolgreicher Klonierung und gleichzeitiger regulatorischer Aktivität der Abschnitte eine blaue Färbung hervorrief. Aus den Versuchen resultierten verschiedene, teils überlappende Expressionsmuster, die auf eine vielgestaltige regulatorische Aktivität der untersuchten Kandidaten hinweisen. Die Expression trat auch an Stellen auf, die nicht mit PITX1 in Verbindung gebracht werden. Trotz einer erfolgreich verlaufenen Klonierung ließ sich kein eindeutiger PITX1-Enhancer identifizieren. Zu vermuten bleibt, dass entweder ein einzelner Enhancer verantwortlich ist, aber durch Art des Versuchsaufbaus unentdeckt blieb, oder dass das Zusammenwirken mehrerer Enhancer in vivo für die korrekte PITX1-Expression verantwortlich ist. Wie die Vielfalt an Expressionsmustern zu der räumlich und zeitlich sehr umschriebenen PITX1-Expression führen könnte, muss eingehender untersucht werden.
The human genome was sequenced more than ten years ago, still the diversity of gene regulation remains to be elucidated. A plethora of regulatory elements has been found to direct the human genome, the rules that govern this territory are slowly being revealed. In this paper, we aim to better understand the regulatory landscape surrounding the homeotic gene PITX1, which has been shown to drive development of the hind limb, and, when ectopically expressed, the forelimb in what has come to be known as the Liebenberg- Syndrome1,2. We selected eight regulatory elements we believed to be enhancers of PITX1 after reviewing conservation tracks, histone modifications and 4C Data from our lab. These were then cloned along with a reporter construct, transfected into embryonic stem cells and transplanted into a mouse. The resulting embryos were harvested on day E11.5 and treated with a staining solution which is metabolized by the reporter gene only when the particular enhancer is active, thus indicating its area of influence. All the Enhancers involved show some sign of staining, though none of the shown expression patterns completely overlaps with the PITX1-pattern anticipated. This discrepancy may be owed in part to the setup, as the single main enhancer of PITX1, should it exist, may have been shrouded. Also, several enhancers acting simultaneously may in fact drive the expression of PITX1, a concept that cannot be investigated with this method. Thus, further research is necessary to fully comprehend genomic interaction at this locus.
