Structural and Functional Analyses of the ScPex13p SH3 Domain and its Interactions with ScPex5p and ScPex14p

Abstract

The docking complex of the peroxisomal protein import machinery consists of at least Pex13p and Pex14p. The C-terminal SH3 domain of Pex13p interacts with the non-PXXP-ligand of Pex5p and the type II SH3-ligand of Pex14p. The ScPex13p (Saccharomyces cerevisiae) SH3 domain was heterologously overexpressed in E. coli and purified in large scale for NMR studies. The solution structure of the Pex13p SH3 domain comprising 62 amino acids from residues 309 to 370 was determined by NMR spectroscopy. This NMR structure was compared with the computer model illustrated in this work. The structure consists of five ?-strand regions and three loops. One of these loops, the n-Src loop, is longer than that in other SH3 domains but appears in all the known Pex13p SH3 domains of different species. The novel binding pocket for Pex5p which binds an ?-helical non-PXXP-peptide and the binding pocket for Pex14p harboring a type II of PXXP motif were identified by the NMR studies. Chemical shift assays revealed both binding pockets for the conventional and non-conventional ligands to be distinct. Pex5p- and Pex14p-peptides can bind simultaneously to the SH3 domain; an access of Pex5p dissociates the Pex14p bound on the SH3 domain. The binding sites of the Pex13p SH3 domain in Pex5p and Pex14p were also located by combination of two hybrid assays and peptide scanning. The binding site in Pex14p was mapped to a classical PXXP motif (type II), which locates between amino acids 86 and 92 in Pex14p; the binding site in Pex5p was mapped to a non classical peptide comprising amino acids 202-215. The interactions among three proteins, Pex5p, Pex13p (SH3 domain) and Pex14p were characterized by NMR studies and surface plasmone resonance studies. These studies indicate that the Pex13p is involved in the dynamics of the peroxisomal protein import process.

Pex13p stellt zusammen mit Pex14p eine Komponente des peroxisomalen Docking- Komplexes dar. Die C-terminale SH3-Domäne von Pex13p interagiert sowohl mit Pex14p als auch mit Pex5p, dem Rezeptor für Proteine mit einem peroxisomalen Targetingsignal-Typ I (PTS1). Die SH3-Domäne von ScPex13p (Saccharomyces cerevisiae) wurde erfolgreich in E. coli überexprimiert und in großen Mengen für NMR-Studien aufgereinigt. Die 3D-Struktur der SH3-Domäne von Pex13p, die 62 Aminosäuren von 309 bis 370 des Proteins umfasst, wurde mittels NMR- Spektroskopie ermittelt. Diese NMR-Struktur und das Computer-Modell wurden miteinander verglichen. Die NMR-Strukur umfasst fünf ?-Faltblatt-Regionen und drei Schleifen. Eine der drei Schleifen, die n-Src-Schleife, ist länger als diejenige der anderen SH3-Domänen. Ein Sequenz-Vergleich ergab, dass die längere n-Src-Schleife in allen bekannten SH3-Domänen von Pex13p vorkommt. Die neuartigen Bindungstaschen der SH3-Domäne des Pex13p für Pex5p und Pex14p wurden charakterisiert. Die beiden Bindungstaschen sind räumlich voneinander getrennt und die Proteine Pex5p und Pex14p können gleichzeitig an die SH3-Domäne des Pex13p binden. Pex14p kann jedoch von der SH3-Domäne des Pex13p durch einen Überschuss an Pex5p abgelöst werden. Die Bindungsmotive in Pex5p und Pex14p für die SH3-Domäne des Pex13p wurden mittels NMR-Studien und Peptid-Bibliotheken identifiziert. In Pex14p stellt diese ein klassisches PXXP-Bindungsmotiv (AS 86-92) dar und entspricht somit einem Typ-II- Bindungsmotiv der SH3-Domäne. In ScPex5p wurde ein neuartiges Motiv, das sich von AS 202-215 erstreckt, identifiziert. Die wechselseitigen Interaktionen zwischen den drei Proteinen Pex5p, Pex13p (SH3- Domäne) und Pex14p wurden durch in vitro Studien charakterisiert. Diese Studien unterstützen die Bedeutung von Pex13p an der Dynamik des peroxisomalen Protein-Imports.