Proteomanalyse humaner Schilddrüsenzellen kultiviert unter Einfluss simulierter Schwerelosigkeit

Abstract

Der Wegfall der Erdanziehung hat auf viele Funktionen des Körpers, wie zum Beispiel auf die Muskeln und Knochen, negative Auswirkungen. Auch auf zellulärer Ebene wurden bei Versuchen zum Beispiel an Bord des Space Shuttles zahlreiche Veränderungen auf die Regulation von Proteinen und Genen beobachtet. Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit war, ob und welche Proteine in Zellen nach Einwirkung simulierter Schwerelosigkeit verändert waren. Untersucht wurden Zellen der Schilddrüse (HTU-5), eines follikulären Schilddrüsenkarzinoms (ML-1), einer Metastase eines follikulären Schilddrüsenkarzinoms im Brustbein (CGTH W-1) und einer Metastase eines follikulären Schilddrüsenkarzinoms in einem Lymphknoten (FTC-133). Die Zellen wurden über die Dauer unterschiedlicher Zeiträume auf einer Random Positioning Machine (RPM) unter simulierter Schwerelosigkeit kultiviert und die gewonnenen Zellproben mit einer massenspektrometrischen Untersuchung untersucht. Für diese Untersuchung wurden die Proteine erst entsprechend ihrer isoelektrischen Punkte (FF-IEF) und anschließend entsprechend ihrer Molekulargewichte (SDS- PAGE) voneinander getrennt. Nach Färbung der Gele wurden ausgewählte Proteinbanden massenspektrometrisch untersucht. Ein Vergleich mit der Literatur ergab, dass von 235 identifizierten Proteinen 37 erstmalig für die Schilddrüse beschrieben wurden. Der Vergleich der MascotTM Scores/emPAI-Werte einiger Proteine unterschied sich für die µg Proben zum Teil deutlich von den 1g Proben. Zur Überprüfung der Aussagekraft dieser Unterschiede wurden für einige Proteine Western Blot Analysen durchgeführt, die die Unterschiede der Massenspektrometrie nur teilweise bestätigen konnten. Jedoch lieferten diese Proteine zusammen Hinweise darauf, dass die Apoptoserate unter µg begünstigt ist oder die für Krebszellen typische Inhibierung der Apoptose geschwächt wird. Enzyme der Glycolyse und Proteine des Cytoskeletts wurden in weiteren Western Blot Analysen für die verschiedenen Zeiträume näher untersucht. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Herkunft der untersuchten Zelllinien einen entscheidenden Einfluss darauf hat, wie die Zellen auf Schwerelosigkeit reagieren und sich anpassen, um zu überleben. Bei den untersuchten Zellen der Schilddrüse zeigte die Zelllinie ML-1 die beste Adaptierung an die Schwerelosigkeit, Zellen der Zelllinie CGTH W-1 die schlechteste. Für die Zelllinie FTC-133 fanden sich Hinweise darauf, dass karzinogene Eigenschaften reduziert werden und die Zellen möglicherweise einen gesunderen Metabolismus aufweisen. Diese Unterschiede im Detail genau zu klären sind Aufgaben zukünftiger Versuche. Zum einen sollte die Regulation des Auf- und Abbau und der Bewegung des Cytoskletts im Hinblick auf daran beteiligte Signalkaskaden genauer untersucht werden. Darüber hinaus sollte der Metabolismus der verschiedenen Schilddrüsentumorzelllinien eingehender untersucht werden. Die Verwendung von Zwischenprodukten der Glycolyse zum Aufbau von Molekülen, die für die Bildung neuer Strukturen in der Zelle benötigt werden, könnte Hinweise darauf geben, wie Zellen auf µg reagieren.

Since 1960, Juri Gagarin and later 1968 Mankind started to explore the universe with the first mission to the moon. Since then, missions to Space became more frequent with the construction of the ISS. The experience of these missions will probably be of great benefit for the planned manned mission to the Mars. During a stay in the outer Space, every organism coming from Earth faces uncommon physical conditions like weightlessness. Developed under the gravitational force of the Earth these organisms have to cope with effects like loss of bone and muscle mass. Furthermore, the effects of weightlessness are not only recognizable on a macroscopic scale but also on the molecular level. Cell culture experiments during Space Shuttle flights revealed that there are many differences in gene and protein expression. The question of this thesis was whether the expression of proteins and of which ones changed in cells exposed to simulated weightlessness. Examined were healthy thyroid cells (HTU-5), cells of a follicular thyroid carcinoma (ML-1), cells of a follicular thyroid carcinoma metastasing to the sternum (CGTH W-1), and cells of a follicular thyroid carcinoma metastasing to a mediastinal lymph node (FTC-133). The cells were cultivated either under normal gravity (1g) or on a Random Positioning Machine (RPM) under simulated weightlessness (µg) for varying periods of time. Cell samples were used to extract lysates which were first subjected to free-flow isoelectric focusing and then to a gelelectrophoretic separation with SDS-PAGE. Selected protein bands were prepared for mass spectrometry and analysed. A comparison with the literature revealed 37 proteins so far unknown for the thyroid. The direct comparison of the mass spectrometry results of the 1g with the µg samples indicated differences to some extent for several proteins. For some of these proteins, western blot analyses verified only partly the reliance of the mass spectrometry results. However, taken together the results provided evidence that under µg apoptosis increases or that the for cancer cells typical inhibition of apoptosis is neutralized. Furthermore, enzymes of the glycolysis and cytoskeletal proteins examined indicated that the behavior of cells might depend essentially on their origin. For the mentioned thyroid cell lines, the cell line ML-1 appeared to possess the best ability to adapt to µg, whereas the cell line CGTH W-1 the worst. For the cell line FTC-133, there were hints that the cells possibly regain a healthy metabolism. To elucidate these differences in more detail will be a challenge for future investigations. Experiments should address the regulation of the formation and of the movement of the cytoskeleton especially in regard of the signaling cascades involved. Furthermore, the products of the metabolism of the different thyroid cell lines could give a hint how these cells adapt to µg and what kind of molecules are required for this.